[发明专利]一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法

说明书

本发明提供一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，将经过密码子优化后的编码猪α干扰素的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后，通过层层筛选，最终获得可以产生猪α干扰素的酵母重组工程菌株。本发明设计使用的表达载体为分泌表达载体，在发酵表达后，培养得到的目的产物在细胞发酵液上清中，便于后期纯化处理。

技术领域

本发明涉及猪α干扰素技术领域，尤其是一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是动物机体在病毒等的刺激下产生的一种具有抗病毒活性的细胞因子，干扰素有I，II，III三种类型,具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫等生物学活性，其中IFN-α的抗病毒活性最强。猪α干扰素(poricine interferon-α)是由猪白细胞产生，具有良好的抗病毒活性。重组猪α干扰素是利用基因工程表达的一种干扰素，具有天然猪α干扰素抗病毒的广谱性和高效性。

IFN-α是一种生物蛋白，它可高效诱导细胞产生抗病毒蛋白(anti-virus，AVP)等效应分子，AVP是一类酶类，作用无特异性，对多数病毒均有一定的抑制效果。IFN-α既能在机体受到感染的初始阶段，中断体内受感染细胞的病毒复制过程，限制病毒增殖、扩散，在体液免疫、细胞免疫发生作用之前发挥重要的抗病毒作用，又能及时且高效的激活、协调体液免疫和细胞免疫。但是IFN-α具有种属特异性，一般在同类物种上活性高，而不同物种则活性较低或者无活性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法。

本发明的技术方案为：一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1)、构建重组猪α干扰素的克隆载体，根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性和GC含量得到优化的猪的α干扰素poIFN-α；

S2)、E.coli TOP10F’工程菌的获得；

S3)、重组表达载体的构建

S301)、根据含密码子优化后的猪α干扰素poIFN-α的核苷酸序列，设计上下游引物，在5’端引物的上游加入XhoI和AAA AGA核苷酸序列，在3’端下游加入终止密码子和EcoRI酶切位点；

上游引物为：5’CCG GAATTC AAAAGATGTGATCTACCTCAGA

下游引物为：5’CCG CTCGAG CTATTATTCTTTTTTTCTC

S302)、将合成的目的基因片段插入到pUC18克隆质粒上，以pUC18-poIFN为模板，以上、下游引物为引物；

S303)、目的基因片段与质粒的连接；

S304)、构建的重组质粒的鉴定；

S305)、重组质粒经酶切线性化处理；

S4)、将线性化产物导入表达宿主菌；

S401)、毕赤酵母感受态细胞的制备；

S402)、将线性化质粒电转化毕赤酵母感受态细胞；

S403)、重组菌株的抗性筛选；

S404)、重组酵母菌的鉴定以及高拷贝的筛选；

S5)、高拷贝重组酵母菌的诱导表达

S501)、高表达菌株的初筛；

S502)、高表达菌株的复筛。

作为优选的，步骤S2)中，E.coli TOP10F’工程菌的获得如下：