[发明专利]检测女性阴道32种病原微生物的引物组、探针和方法

说明书

本发明提供了检测女性阴道32种病原微生物的引物组、探针和方法，该检测方法共检测女性阴道内32种阴道炎相关的病原微生物，其中除乳杆菌外，其余均为致病菌，覆盖度广，该检测中几乎包含所有常见及致病性病原微生物；相比于现有的检测方法，检测效率高，仅需1次反应，可同时检测多种病原微生物，自动化程度高，能在2小时内检测出多达32种病原微生物，具有操作便捷、特异性强、灵敏度高的优点，且该检测系统的假阳性及假阴性率显著下降，具有受污染小、安全性高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于阴道微生态系统检测技术领域，涉及检测女性阴道32种病原微生物的引物组、探针和方法。

背景技术

正常的健康妇女，阴道由于解剖组织的特点对病原的侵入有天然的防御功能。如阴道口的闭合，表皮细胞角化，阴道酸碱度保持在pH 4-5，使适应碱性的病原如厌氧菌的繁殖受到抑制等。当阴道的自然防御功能受到破坏时，病原易于侵入，发生阴道炎症。

阴道炎症是女性常见病、多发病，除可引起患者外阴阴道不适症状以外，还可导致一系列与生殖健康相关的严重并发症，危害女性生殖健康。常见阴道炎症包括细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)、需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis，AV)、阴道毛滴虫病(tri chomoniasis)和外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)等。

女性阴道微生态系统是人体微生态系统的组成之一，由阴道内的微生物菌群、内分泌调节系统、阴道解剖结构和局部免疫系统共同组成。阴道微生物菌群种类繁多，相互共生和拮抗，受到体内、外各种因素的影响，参与形成结构复杂的微生态系统。正常的阴道微生物菌群以乳杆菌为优势菌，可伴有少量其他杂菌共生。阴道乳酸杆菌对维持阴道正常菌群起着关键作用。阴道上皮的糖原经乳酸杆菌的作用分解为乳酸，使阴道局部呈弱酸环境。下列情况有可能影响阴道生态系统的平衡：①性激素：如月经期前后雌激素水平降低，导致阴道内pH上升有利于厌氧菌的生长。②某些杀精子的避孕药膏对乳酸杆菌有毒性作用。③药物：许多种药物如广谱抗生素可杀灭或抑制乳酸杆菌而影响阴道内的环境。④感染；如妇女性乱，可干扰阴道内原有菌群而导致失调。阴道微生态平衡失调时，可发生以阴道菌群异常和阴道pH值异常为特征的改变，是1种趋势性的变化，可导致阴道对致病微生物的抵抗力降低，继发感染。

目前，临床上阴道微生态系统检测主要包括形态学检测及功能学检测。前者包括菌群密集度、多样性、优势菌、病原微生物、各项疾病评分等形态学指标；后者通过功能学检测判定微生物功能的状况，主要是测定阴道微生物的代谢产物及酶的活性；两者互为补充，从而综合评价阴道微生态状况。

1.形态学检测：阴道分泌物涂片，干燥、固定后，行革兰染色，油镜下检查阴道菌群。该检测方法虽然准确性高，但操作复杂、周期长，不适于作为常规检测方法。

2.功能学检测：用留取阴道分泌物的湿棉签，检测需氧菌、厌氧菌、真菌、滴虫等的代谢产物、酶的活性及pH值。该检测方法容易受到干扰，比如标本采样不符合试剂盒标本采样要求(24小时内有过性交、盆浴、阴道灌洗、雌激素使用者、孕期等)。

荧光定量PCR(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR技术具有通量高、特异性强、灵敏度高、全封闭反应、自动化程度高、速度快等特点，广泛应用于临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全等多个领域。

经检索，目前运用荧光定量PCR技术的检测阴道病原微生物的专利，例如，“诊断细菌性阴道炎的方法-CN102770559A”、“一种采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法-CN106350581A”等，只检测几种或十几种常见阴道病原微生物，未见在同一次检测中实现几十种病原微生物同时检测的专利。

发明内容