[发明专利]一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的构建与应用

权利要求书

1.一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)rBJ1805-2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202250，保藏日期为2022.6.29。

2.一种用于构建NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pACYC177-rBJ1805-2，所述重组载体以pACY177质粒为载体，其中含有NADC34-like PRRSV2 BJ1805-2分离株的全基因序列，所述全基因序列如SEQID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述的方法如下：

提取NADC34-like PRRSV2分离株BJ1805-2的RNA，使用反转录试剂盒将病毒RNA反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，通过设计引物分段扩增的方法扩增NADC34-like PRRSV2分离株BJ1805-2全基因，再将扩增产生的各个片段分别进行测序，最后通过序列比对软件拼接获得NADC34-like PRRSV2BJ1805-2分离株的全基因序列；

以pACY177质粒为载体，利用PCR扩增、酶切连接方法将NADC34-like PRRSV2 BJ1805-2分离株的全基因序列分段连接到载体上，获得BJ1805-2全长感染性克隆重组质粒；

然后通过感染性克隆的方法对所述NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒进行拯救，所述拯救获得的病毒为NADC34-like PRRSV2感染性克隆病毒rBJ1805-2。

4.根据权利要求3所述一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述方法中，用于扩增NADC34-like PRRSV2分离株BJ1805-2全基因的引物组如下：

5.根据权利要求3所述一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述方法中，获得BJ1805-2全长感染性克隆重组质粒的方法如下：

(1)BJ1805-2全基因片段分段扩增

BJ1805-2全基因组被分为三个片段进行扩增；

(2)BJ1805-2各片段连接

使用产物纯化试剂盒纯化上述扩增产物，纯化产物与pACYC177质粒双酶切，依次连接到pACYC177载体，最终获得含全基因组序列的感染性克隆质粒pACYC177-rBJ1805-2。

6.根据权利要求5所述一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)BJ1805-2全基因片段分段扩增中，在BJ1805-2基因组的5’端引入PacI单酶切位点，3’端加入丁型肝炎病毒(HDV Ribozyme)序列，且采用如下引物组：

7.根据权利要求6所述一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)BJ1805-2全基因片段分段扩增中，采用如下方法：

首先，将引物BJ1805-2-PacI-F1和BJ1805-2-Bsu36I-R1；BJ1805-2-Bsu36I-F2和BJ1805-2-XbaI-R2组合，扩增得到BJ1805-2-F1和BJ1805-2-F2片段；

其次，扩增BJ1805-2-F3需要分两步进行；先使用BJ1805-2-XbaI-F3和BJ1805-2-1R3引物对，扩增得到F3-1；然后，以F3-1作为模板，BJ1805-2-XbaI-F3和BJ1805-2-AscI-2R4引物组合，扩增得到F3-2。