[发明专利]一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的构建与应用

说明书

本发明涉及一株NADC34‑like PRRSV2的反向遗传操作构建的病毒。具体包括以pACY177质粒为载体，利用PCR扩增、酶切连接等方法将NADC34‑like PRRSV2 BJ1805‑2分离株的全基因序列分段连接到载体上，获得BJ1805‑2全长感染性克隆重组质粒（rBJ1805‑2）。体外拯救了感染性克隆病毒rBJ1805‑2，成功搭建了我国首个NADC34‑like PRRSV2毒株感染性克隆平台。本发明还涉及一种构建可适应Marc‑145细胞传代培养NADC34‑like PRRSV2毒株的改造方法。本发明所构建的感染性克隆病毒有良好的体内外增殖效力，接种猪体可以引起特异性病毒血症；具有良好的安全性，接种猪体后不引起发热，更不会引起仔猪死亡。所改造毒株可作为候选毒株用于研制我国首个NADC34‑like PRRSV2特异性疫苗，有利于我国PRRSV疫情的防控。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆病毒以及基于该毒株编辑产生的一株具有Marc-145细胞嗜性的改造病毒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害我国养猪业健康发展的重要病原。PRRSV感染可引起母猪流产和仔猪呼吸系统综合征。最新研究将PRRSV分为两个种(species)：PRRSV1和PRRSV2。我国主要流行的是PRRSV2，其中以高致病性PRRSV2(HP-PRRSV2)、NADC30-like PRRSV2和NADC34-like PRRSV2为主。其中，我国NADC34-likePRRSV2毒株最早于2017年报道并迅速在全国各地传播流行。该毒株猪体适应性强，毒力变化大，给我国养猪业造成极大经济损失。

PRRSV是一种单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科，其基因组大小约为15kb，包含10个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b基因编码至少16个非结构蛋白，ORF2-7基因编码8个结构蛋白。其中，ORF2-4基因编码的三种小囊膜蛋白(GP2a，GP3和GP4)通过非共价键形成异三聚体，在PRRSV感染靶细胞中发挥关键作用。有研究表明GP2a，GP3和GP4是决定PRRSV细胞嗜性的关键蛋白。

疫苗免疫是防控我国PRRS疫情的主要手段。但现有商品化PRRS弱毒疫苗交叉保护效果差，且尚未研制出NADC34-like PRRSV2毒株特异性的弱毒疫苗。此外，NADC34-likePRRSV2分离株不具有Marc-145细胞嗜性，是阻碍其特异性疫苗研制的重要障碍。

反向遗传操作技术已成为新型基因工程疫苗研制的重要手段。但是目前尚未有NADC34-like PRRSV2反向遗传操作平台构建的报道，更没有基于NADC34-like PRRSV2改造获得Marc-145细胞嗜性病毒的报道。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题，针对我国近年来出现并广泛流行的NADC34-like PRRSV2毒株，本发明提供一株NADC34-like PRRSV2感染性克隆病毒的构建方法，同时在其基础上获得了一株可适应Marc-145细胞体外传代培养的NADC34-like PRRSV2改造毒株。这一改造毒株可作为候选毒株用于研制我国首个NADC34-like PRRSV2特异性疫苗。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)rBJ1805-2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202250，保藏日期为2022.6.29。

一种用于构建NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的重组载体，所述重组载体为pACYC177-rBJ1805-2，所述重组载体以pACY177质粒为载体，其中含有NADC34-like PRRSV2 BJ1805-2分离株的全基因序列，所述全基因序列如SEQ ID NO:1所示。