[发明专利]一种生物样品中纳呋拉啡的检测方法

权利要求书

1.一种生物样品中纳呋拉啡的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱-质谱联用进行测定，包括以下步骤：

S1、标准曲线样品配制；

S2、质控样品配制；

S3、内标溶液配制，内标溶液为1ng/mL的纳曲酮；

S4、生物样品前处理，具体包括如下步骤：

S41、将固相萃取小柱活化；

S42、取用1mL生物样本与500μL内标工作液涡旋混合后，分2次上样至已活化完成的固相萃取小柱，采用负压抽滤装置对样本进行抽滤，摒弃样本抽滤液；

S43、采用2mL纯水作为淋洗液分2次对已上样的固相萃取柱进行淋洗，采用负压抽滤装置对淋洗液进行抽滤，摒弃抽滤后的淋洗液；

S44、采用1mL 0.1％甲酸甲醇溶液作为洗脱液对已淋洗完成的固相萃取柱进行洗脱，采用负压抽滤装置对洗脱液进行抽滤，收集抽滤后的洗脱液；

S45、对收集完成的洗脱液进行氮吹处理，直至洗脱液完全吹干；

S46、复溶吹干后的EP管，涡旋至少2分钟；

S47、取复溶后样品至进样管中，4℃，13000-15000rpm离心5-10分钟后进样分析；

S5 LC-MS/MS方法检测；

通过LC-MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中纳呋拉啡的浓度。

2.如权利要求1所述的生物样品中纳呋拉啡的检测方法，其特征在于，S5中LC-MS/MS方法的色谱及质谱条件如下：

色谱条件：液相型号为SHIMADZU LC-20A或SHIMADZU LC-30A；

色谱柱为SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ，2.1*50mm，3μm；

流动相A相为0.1％甲酸水溶液；

流动相B相为0.1％甲酸甲醇

梯度洗脱条件包括如下五个阶段：

第一阶段0.00-0.80min：起始流动相比例A:B＝90:10；

第二阶段0.80-1.50min：流动相比例由A:B＝90:10B相缓慢上升至A:B＝30:70；

第三阶段1.50-2.60min：流动相比例A:B＝30:70；

第四阶段2.60-2.61min：流动相比例由A:B＝30:70B相迅速下降至A:B＝90:10；

第五阶段2.61-3.50min：流动相比例A:B＝90:10；

流速为：0.8mL/min；进样量为：5-10μL。

质谱条件：AB SCIEX API 6500+或QTRAP 6500型号质谱，ESI源，正离子，离子喷射电压为5500V，温度550-600℃，雾化气压力为55psi，解簇电压压力为55psi，气帘气体压力为35-40psi，扫描方式为多重反应监测(MRM)，纳呋拉啡和内标的质谱参数为：

纳呋拉啡的质谱参数为：Q1，477.4；Q3，308.1；Dwell time，200；DP，80；EP，10；CE，42；CXP，18；

纳曲酮的质谱参数为Q1，342.4；Q3，270.1；Dwelltime，200；DP，95；EP，10；CE，37；CXP，15；

其中，Q1—母离子(amu)；Q3—子离子(amu)；Dwell time—驻留时间(msec)；DP—去簇电压(v)；EP—射入电压(v)；CE—碰撞能量(v)；CXP—碰撞室射出电压(v)。

3.如权利要求1所述的生物样品中纳呋拉啡的检测方法，其特征在于，所述生物样品选自犬的血浆或血清样品、大鼠的血浆或血清样品、猴的血浆或血清样品或受试者的血浆或血清样品。

4.根据权利要求1所述的生物样品中纳呋拉啡的检测方法，其特征在于：所述固相萃取法的固相萃取小柱为：Phenomenex，Strata^TM-X(30mg，1cc³)。

5.根据权利要求1所述的生物样品中纳呋拉啡的检测方法，其特征在于：所述固相萃取时先后使用1mL甲醇和1mL纯水进行固相萃取小柱的活化。