[发明专利]天冬氨酸激酶突变体及其在生产L-高丝氨酸中的应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体公开酶活提高的天冬氨酸激酶突变体及其在制备L‑高丝氨酸或其衍生物中的应用。所述突变体的氨基酸序列相较于酿酒酵母来源的野生型天冬氨酸激酶，存在V299A、N317S、N485S、Q107R/N317S、T114S/Q510R、T155A/K390E中一个突变类型。在具体实施中，经诱导表达纯化的酶活性测定分析，所述突变体的酶活性比野生型提高了1.7~3.8倍。因此，本发明提供的有益突变体可以为工业化高效生产L‑高丝氨酸及下游代谢产物奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体公开酶活提高的天冬氨酸激酶突变体及其在制备L-高丝氨酸或其衍生物中的应用。

背景技术

L-高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，也是甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸的前体，参与体内多种生理生化反应和多个生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。高丝氨酸及其衍生物具有丰富的生物活性，可作为抗真菌药物，有效的抑制镰状红细胞，衍生物高丝氨酸甲酯是具有抗癌活性化合物Chinese bittersweet alkaloid的重要中间体。高丝氨酸还是用来合成新型农药L-草铵膦的主要原料，草铵膦作为内吸传导型除草剂，因其具有广谱除草高活性，现已在国外发达国家得到广泛应用，且需求量逐年递增。由于人们对这些药物的迫切需要，刺激了对关键中间体L-高丝氨酸的大量需求。此外，高丝氨酸在农作物肥料添加剂和畜牧业饲料添加剂中具有潜在的应用前景，例如在雏鸡日粮中，高丝氨酸具有和苏氨酸相似的生物活性，在缺乏苏氨酸情况下，高丝氨酸可以替代苏氨酸改善幼雏的生长性能。同时高丝氨酸为中间体可以转化合成为丙烯酸、3-羟基丙酰-CoA、3-羟基丙酸酯、聚-3-羟基丙酸酯和1,2-丙二醇。综上所述，高丝氨酸作为中间体或原料能够合成多种化工产品、农药及饲料，可应用于食品、化妆品、医药和饲料等领域，具有广阔的应用前景。

目前，L-高丝氨酸的合成方法主要是化学法和生物酶法。化学法以L-甲硫氨酸或天冬氨酸为原料，需要使用碘化物和大量有机溶剂，并且生成硫化物，伴随着严重的环境和安全问题。生物酶法是以丙酮酸和醛类化合物为原料，在醛缩酶、甲酸脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶复合酶的共同催化下反应得到高丝氨酸，成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需要使用价格昂贵的辅酶等。近年来，微生物发酵生产L-高丝氨酸受到越来越多的关注，微生物发酵法提供了一种安全、经济效益高、环境友好的替代生产策略。

在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等微生物中，L-高丝氨酸的生物合成是从天冬氨酸支路途径开始的。葡萄糖经过糖酵解途径、磷酸戊糖途径和TCA循环等生成草酰乙酸前体，并进入天冬氨酸支路途径；然后天冬氨酸前体在天冬氨酸激酶（Aspartokinase，EC:2.7.2.4）、天冬氨酸半醛脱氢酶（Aspartate-semialdehyde dehydrogenase，EC:1.2.1.11）和高丝氨酸脱氢酶（Homoserine dehydrogenase，EC: 1.1.1.3）等顺次催化下最终生成L-高丝氨酸。其中天冬氨酸激酶是高丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等天冬氨酸家族氨基酸合成途径中第一个共同关键酶，能够将中心碳代谢流引入天冬氨酸支路，其催化活性常受到末端产物或中间代谢物的反馈抑制或阻遏效应。因此，通过筛选或分子改造天冬氨酸激酶，获得具有优良的催化性能的关键酶突变体，对于天冬氨酸家族氨基酸的高效生产都具有非常重要的意义。

发明内容

基于上述需求，本发明的首要目的在于提供天冬氨酸激酶突变体，以使得其催化性能得到提升，有利于微生物发酵生产L-高丝氨酸等代谢产物。