[发明专利]可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌构建及在抗逆育种中应用

说明书

本发明公开了一种具有可控高突变率的谷氨酸棒杆菌及其应用。利用基因工程方法敲除或敲降了谷氨酸棒杆菌出发菌中的nucS或/和xpb或/和tagI基因，进一步过表达dinP基因，能够有效提高谷氨酸棒杆菌的自然突变频率，有助于实现在特定环境胁迫条件下“边突变边筛选”目的，快速选育具有优良抗逆性、适配性和稳定性的基因工程菌。该工程菌具有高突变率和较好可控性，可实现体内基因组连续突变进化，能够大大缩短实验室适应性进化周期，具有广阔应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建及其在抗逆育种中应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的食品安全级工业微生物菌种，已被广泛用于多种氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和维生素等的生物合成，具有重要的经济价值和应用前景。但是在工业发酵条件下，例如发酵生产谷氨酸及其衍生产品时，谷氨酸棒杆菌时常面临着诸多的生理或非生理逆境胁迫，严重影响菌种的正常生理状态以及相关目标产物的高效积累，其中低酸胁迫、高温胁迫、高渗胁迫等是比较常见的环境胁迫压力。高性能的微生物菌种是发酵工程的基础，也是提高生物发酵产品产量和质量的重要保障，拥有优良稳定抗逆表型的工程微生物对于实现更高的发酵产量、产率和生产强度是必需的。但是由于技术手段和理论知识的限制，传统代谢工程较多集中于局部代谢网络的调控和优化，而对菌株外界环境胁迫的响应机制解析和耐受性能改造的认识和研究，一直以来是工业微生物遗传改造的短板。

适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution, ALE)是通过模拟自然进化中的变异和选择过程，以特定或逐渐增加的胁迫来筛选性能优良的突变体，是实现对微生物菌株优良性状选育的常用方法之一。虽然该方法是获得优异工程菌株的一种有效策略，但是由于微生物自然突变率水平极低，适应性进化可能需要较长时间连续培养才能积累突变，上述过程周期冗长且易在传代中容易染菌而导致进化失败。另外，由于随机突变的自身性质和频率是难以控制的，获得的有益突变种类和数量通常较少，适应性实验室进化在选育高性能微生物底盘菌方面仍具有较大局限性。

菌株突变表型通常是由编码DNA修复酶和蛋白质的基因功能失调引起的，这些基因确保了DNA复制的准确性。微生物在长期进化过程中发展出了许多修复DNA损伤的策略方法，包括碱基切除修复系统、核酸切除修复系统、错配修复系统、同源重组修复系统和SOS修复系统等，理论上通过敲除、敲降或者过表达相关修复途径基因，可以提高微生物的基因组复制突变率，从而使其加快适应生理环境胁迫。微生物生活在不断变化的环境中，具有一种根据对环境的适应程度来调节突变率的生存策略。当适应能力受到遗传变异性的限制时，生物体自然选择倾向于群体中突变率较高的细胞。因此，可控高突变率对于微生物环境适应是有利的，将有助于增加有益突变产生概率，使微生物在一个相对较短的连续逆境周期内获得鲁棒性明显提升的进化表型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法及其应用，利用该工程菌建立基因组水平连续突变提升工具，可以实现在给定环境胁迫条件下的“边突变边筛选”，达到具有优良抗逆表型的谷氨酸棒杆菌工程菌可控高效选育目标。