[发明专利]一种用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法

说明书

本发明公开一种用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法，将果蔬样品进行前处理，提取果蔬样品农药残留提取物，将1 hpf野生型AB系斑马鱼暴露于样品120 h至5 dpf，每天观察并记录斑马鱼毒性及死亡情况，及时移除死亡斑马鱼，在暴露期结束后，观察并记录斑马鱼器官和组织毒性情况，评价果蔬农药残留安全性。本方法检测准确度高，检测方法科学合理，造模周期短使得检测成本大大降低，为向广大民众、企业、政府普及推广该检测方法提供了现实可行性。

技术领域

本发明属于蔬菜水果安全性评价的技术领域，具体涉及一种用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法。

背景技术

现有果蔬农残检测基本是靶向性的，即只针对已假定的一种或多种农药。由于未对整体情况进行全面检测评估，不能检测未知的有毒物质、无法检测多种物质之间是否有复合毒性，故不能告知样品是否真正安全。现有的农残快速检测方法基于酶抑制法，也只可筛查有机磷和氨基甲酸酯类，对有机氯、菊酯类等无效。

采用模型动物评估危害，无疑更为直观、客观和系统性。斑马鱼生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，能反映化合物吸收、分布、代谢与排泄的过程。而且，斑马鱼与人类基因组的相似度高达87%，有与人类近似的毒性特征和信号传导通路，斑马鱼的各种器官和组织在体视学、生理学和分子水平上类似于哺乳动物，因此是一种可比性较强的模式生物，可以用于各种类型样品的安全性评价。用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法，是果蔬中农药残留检测技术手段的重要补充，具有快速、高通量、非靶向、成本低、对高端仪器设备依赖小等优点。

发明内容

为了能够更为直观、客观和系统性的检测出果蔬中农药残留，本发明提供一种用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法，将果蔬样品进行前处理，提取果蔬样品农药残留等外源性物质，将1 hpf野生型AB系斑马鱼暴露于样品120 h至5 dpf，每天观察并记录斑马鱼毒性及死亡情况，及时移除死亡斑马鱼，在暴露期结束后，置于体视显微镜下观察并记录斑马鱼心脏、循环系统、出血及血栓、脑、下颌、眼睛、肝脏、肾脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、身体着色、体长等反应情况，采集典型毒性器官照片，以各器官的毒性发生率评价样品对斑马鱼的急性毒性，并鉴别毒性靶器官，评价果蔬农药残留安全性。

具体的，一种用斑马鱼非靶向评价果蔬农药残留安全性的方法，包括以下步骤：

S1.果蔬样品前处理：用有机试剂提取果蔬样品，盐析分层，浓缩复溶得到果蔬样品农药残留提取物；

S2.农药残留安全性评价：取步骤S1中制备的提取物，用稀释储备液进行稀释，取挑选的受试斑马鱼暴露于含有提取液稀释液的微孔板中，一定暴露条件下暴露后，每天观察并记录斑马鱼毒性及死亡情况，经结果处理后评价其安全性。

进一步地，所述步骤S1中果蔬样品前处理如下：称取50g样品于400mL高脚烧杯中，加入100mL乙腈，均质2min，过滤至装有10～14g氯化钠的250mL具塞量筒中，剧烈振摇1min，静置分层，取上层乙腈溶液至100mL梨形瓶中，旋转蒸发至近干，加入1mL甲醇复溶。

进一步地，所述步骤S2中稀释储备液成分及含量为294.0 mg/L CaCl₂·2H₂O、123.3 mg/L MgSO₄·7H₂O、63.0 mg/L NaHCO₃、5.5 mg/L KCl，稀释储备液pH在6.5至8.5之间，应避免使用过多溶剂，若需要使用溶剂以产生适当浓缩的储备液，在使用溶剂辅助制备储备液的情况下，其最终浓度不应超过斑马鱼的最大耐受量，并且在所有实验容器中应相同，当使用溶剂时，需要额外的溶剂对照。

进一步地，所述受试斑马鱼选取4细胞阶段到16细胞阶段的受精卵进行检测，体视显微镜下观察鱼卵，从4细胞阶段开始，受精卵可以清楚地从非受精卵中分辨出来，若该批次鱼卵的受精率小于70％，则不适用该批鱼卵进行检测，且去除细胞分裂明显异常（如不对称、囊泡等）或者细胞膜损坏的卵。