[发明专利]一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法

权利要求书

1.一种关于肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括：

首先，对肾组织石蜡切片进行烤片、脱蜡、阶梯式水化以及PBS浸泡处理；

其次，利用沸腾的柠檬酸修复液对浸泡后的切片进行初次抗原修复处理，缓慢冷却至室温，然后利用PBS缓冲液洗涤，甩干；

然后，将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复处理；并利用PBS缓冲液对修复后的切片进行冲洗；

最后，进行封闭、滴加一抗与二抗、复染核、封片处理。

2.如权利要求1所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括以下步骤：

步骤一，获取肾组织石蜡切片，进行烘烤、脱蜡处理以及阶梯式水化处理，然后利用自来水冲洗2min，再利用PBS磷酸盐缓冲液浸泡；

步骤二，将浸泡后的切片放入加热沸腾的柠檬酸修复液中，并利用微波炉再次加热进行初次抗原修复；利用扎有多个小洞口的保鲜膜将加热后的柠檬酸修复液进行封口处理，缓慢冷却至室温，再利用PBS磷酸盐缓冲液洗涤组织切片，甩干；

步骤三，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复；并利用PBS缓冲液对修复后的组织切片进行洗涤，甩干；

步骤四，利用山羊血清封闭液对切片组织进行封闭处理，封闭结束后再向切片组织处滴加稀释后的COL4A3或COL4A4抗体，4℃孵育过夜；

步骤五，第二天，取出抗体孵育结束的组织切片，室温下复温30min，利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；向所述切片组织滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温下避光孵育1h；孵育结束后，避光环境下，利用PBS磷酸盐缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；

步骤六，向所述切片组织滴加稀释后的DAPI，避光孵育10min，对标本进行染核；然后再利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；

步骤七，滴加含抗荧光淬灭剂的封片液，封片；在激光共聚焦显微镜下采集图像。

3.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤一中，将获取的肾石蜡组织切片进行烘烤、脱蜡处理包括：

所述烘烤处理包括：

将获取的肾组织石蜡切片(切片组织厚度3-3.5μm均可)放置于60℃恒温箱中烘烤30min；

所述脱蜡处理包括：

利用二甲苯液体将烘烤后的肾组织石蜡切片浸泡10min；另一个二甲苯液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡10min。

4.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤一中，阶梯式水化处理包括：

首先，利用100％的酒精对切片组织水化5min；

其次，利用95％的酒精对切片组织水化5min；

然后，利用80％的酒精对切片组织水化5min；

最后，利用75％的酒精对切片组织水化5min。

5.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤二中，沸腾的柠檬酸修复液由微波炉在100W火力下加热得到。

6.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤二中，利用微波炉加热放置有肾组织石蜡切片的柠檬酸修复液包括：将微波炉火力调整为40W，加热放置有组织切片的柠檬酸修复液10min。

7.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述利用PBS磷酸盐缓冲液对所述切片组织进行洗涤包括：利用PBS磷酸盐缓冲液对组织切片洗涤3次，每次5min。

8.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤三中，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复包括：将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复。