[发明专利]一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法

说明书

本发明属于组织荧光染色技术领域，公开了一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括：对肾石蜡病理切片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复、标记、封闭、滴加一抗与二抗、复染核、封片处理。本发明能够解决既往大部分使用冰冻组织切片进行荧光染色的弊端，因石蜡切片能够长期永久保存，本发明提供了一种关于肾石蜡切片的抗原修复方法，此方法抗原定位效果佳、稳定、安全系数相对较高，可以对多年前的肾活检标本进行相关免疫荧光染色，从而进行既往病例的回顾性研究，避免了病人再次进行肾活检检查，减少了病人的创伤性操作及减轻了操作中产生的痛苦。

技术领域

本发明属于组织荧光染色技术领域，尤其涉及一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法。

背景技术

肾小球基底膜(GBM)将足细胞和内皮细胞分开，有助于肾小球过滤屏障的大小和电荷选择性，使水和小分子进入尿空间，将大分子和细胞保留在循环中，是肾小球滤过屏障的重要组成部分。

肾小球基底膜(GBM)的主要成分是层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白和IV型胶原蛋白，后者是最丰富的。IV型胶原蛋白家族由6个α链，即α1-α6链组成，由2、13和X染色体上的三对基因编码，它们组装形成空间相容性异源三聚体的三种组合：α1α1α2、α3α4α5和α5α5α6。α1α1α2异源三聚体是胚胎发育过程中身体所有基底膜的特征。在发育过程中，基底膜会改变其组成，在GBM、耳蜗、眼睛、睾丸和肺中用α3α4α5代替α1α1α2异三聚体。因此，COL4A3、COL4A4或COL4A5中的任何一个发生突变将引起α3α4α5异源三聚体的缺失或功能失调，以及α1α1α2异源三聚体的持续存在，从而导致Alport综合征(表现为进行性肾功能丧失、感音神经性听力损失和各种眼部异常等)等等。

最近，由COL4A3或COL4A4杂合突变引起的IV型胶原肾病的范围不断扩大。大约40％的薄基底膜肾病患者由COL4A3或COL4A4杂合突变引起；大约15％的Alport综合征是COL4A3或COL4A4基因突变引起的常染色体遗传，其中以常染色体隐性遗传最为常见，有极少数为常染色体显性遗传。

因此，采用抗Ⅳ型胶原α3、α4链单克隆/多克隆抗体，对肾活检组织进行免疫荧光染色，对于常染色体隐性或显性的Alport综合征患者的诊断、基因携带者的筛查以及遗传型的判断具有重要价值。另外，肾组织的免疫组织学研究也有助于鉴别Alport综合征和薄基底膜肾病，因为后者未显示GBM中IV型胶原链分布的任何异常。

目前的肾脏组织免疫荧光检查常用冰冻组织切片，有时冰冻组织荧光染色时没有肾小球，或患者因素致冰冻组织只有硬化球，无法进行免疫荧光检查等局限；另外冰冻切片机价格昂贵，基层单位开展困难，且组织不易保存，不能对既往病例进行回顾性诊断及研究；运送组织标本条件要求苛刻，稍不慎温度过高抗原遭破坏会导致假阴性结果；更关键的是冰冻组织细胞结构不清晰、完整性差，有时结果很难判断。

而多聚甲醛或者福尔马林固定的石蜡包埋组织切片比冰冻切片显示出保存更好的组织结构和细胞形态，可以进行准确的抗原定位；荧光猝灭时间明显长于冰冻切片，更利于判读；且切片薄，无褶皱，能大大节省标本；另外石蜡切片易于保存，可在常温下保存多年。因此，这类切片可广泛用于诊断和研究目的。

但是，肾活检标本制成石蜡切片后，即使应用低温石蜡包埋，其中的抗原决定簇必然与甲醛结合而被覆盖，影响组织抗原性。因此，在进行免疫组化或者免疫荧光检查前，需要进行抗原修复技术来断开固定过程中产生的蛋白交联，显著提高免疫病理抗原检测的敏感性。

现在国内外对遗传性疾病比如Alport综合征的关注度越来越高，因COL4A3或COL4A4基因不同突变位点致病的患者越来越多，目前对新发现的突变位点的研究也越来越多。因此，诊断疾病及研究过程中，进行IV型胶原α3、α4链的免疫荧光染色的需求越来越多。