[发明专利]一种基于MLPA-NGS方法检测特纳综合征的试剂盒及其使用方法和应用

权利要求书

1.一种基于MLPA-NGS方法检测特纳综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SNP探针组合物、CNV探针组合物及引物组合物；其中，所述SNP探针组合物包括分别设计于常染色体、X染色体、Y染色体的SNP探针对，所述CNV探针组合物包括分别设计于常染色体、X染色体、Y染色体的CNV探针对；所述引物组合物包括用于扩增连接后的探针的带有index序列的通用引物，各所述探针对分别包括左侧探针和右侧探针，所述左侧探针的5’端和所述右侧探针的3’端分别包含一段通用序列，其作为所述通用引物扩增时的结合序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SNP探针组合物包括142个探针对，其分别设计于常染色体的66个SNP位点、X染色体的51个SNP位点、Y染色体的25个SNP位点，其中，每一所述SNP位点包含两种基因型：野生型和突变型；所述CNV探针组合物包括84个探针对，其分别为设计于常染色体的44对探针、X染色体的30对探针、Y染色体的10对探针。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SNP探针组合物中，用于结合模板DNA的各所述SNP探针对的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.284所示；所述CNV探针组合物中，用于结合模板DNA的各所述CNV探针对的序列如SEQ ID NO.285～SEQ ID NO.452所示；所述通用引物的序列如SEQ ID NO.453～SEQ ID NO.454所示，左侧探针的5’端的通用序列如SEQ ID NO.455所示，右侧探针的3’端的通用序列如SEQ ID NO.456所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SNP探针组合物和所述CNV探针组合物混合获得探针工作液，所述探针工作液中每条探针浓度为0.2～20fmol/μL；和/或，所述引物组合物中，每一通用引物的配制浓度为2～200pMol；和/或，所述试剂盒还包括MLPA缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、PCR缓冲液、dNTP、PCR酶中的至少一种。

5.一种如权利要求1～4中的任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括步骤：DNA样品变性；SNP探针组合物和CNV探针组合物与DNA样品进行探针杂交；采用连接酶和连接酶缓冲液与杂交探针进行连接反应；将探针连接产物与引物组合物进行PCR扩增；将PCR扩增产物测序，获得测序结果。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，具体包括步骤：

步骤S1、DNA变性和探针杂交：将DNA样品进行变性操作；将MLPA缓冲液与探针工作液充分混合，进行杂交反应，反应程序为：95℃2min，65℃至55℃，每降一度孵育1小时，然后在54℃保持3-10小时，获得杂交产物；

步骤S2、配制含有连接酶缓冲液的连接酶主液，将连接酶加入所述连接酶主液并混匀，54℃加热1分钟，于54℃恒温下加入所述杂交产物中混匀，继续孵育25分钟，于98℃加热5分钟，并冷却至20℃暂停，实现杂交探针的连接，获得连接产物；

步骤S3、将所述连接产物与PCR反应液进行PCR扩增反应，所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dNTP、带有index的上下游通用引物、Taq酶，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，最后15℃孵育，获得PCR扩增产物；

步骤S4、从每个所述PCR扩增产物中各取适量样本，混合均匀，送NGS测序仪上测序，获得测序结果。

7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，每一CNV探针对和每一SNP探针对均各自具有2～4段用于特纳综合征检测的特征性序列；各所述探针对分别包括左侧探针和右侧探针，所述特征性序列分别为从左侧探针与模板DNA结合区域的左侧、左侧探针与右侧探针连接位置、右侧探针与模板DNA结合区域的右侧各截取的具有预定长度的碱基序列；其中，所述特征性序列的序列长度为6～12个碱基，所述特征性序列相互之间至少间隔一个碱基。