[发明专利]一种基于RPA-LFD技术的小普林藻检测方法及试剂盒

说明书

本发明设计了适于对小普林藻的特定特征序列进行RPA法扩增的引物和方法，并结合LFD技术，对水样中的小普林藻进行检测。使用本发明的试剂盒和方法，只需要带着恒温装置即可在地进行水样的小普林藻检测，检测时间控制在20min内，检测费时短，无需PCR仪、电泳仪以及凝胶成像系统等复杂设备。此外，本发明的方法特异性好，灵敏度远高于传统PCR，基因组最低检测限可达到1.5×10supgt;‑1/supgt;pg/μL，模拟样本最低检测限可达到1.12×10supgt;‑1/supgt;细胞/mL，为水体有害藻类监测提供了新的工具。

技术领域

本发明属于水环境保护领域，更特别地，涉及一种基于RPA-LFD技术的小普林藻检测方法及试剂盒。

背景技术

小普林藻 (Prymnesium parvum)属于定鞭金藻门(Haptophyta)，颗石藻纲(Coccolithophyceae)，定鞭金藻目(Prymnesiales)，定鞭藻科(Prymnesiaceae)，普林藻属(Prymnesium)，于1930年在丹麦水域首次发现并被记录，为全球广布种，常在我国各个地区的沿海(大连、天津等)和内陆淡咸水水体(陕西、宁夏等)频繁发生藻华，经研究认证其为海洋起源，如何侵入淡水水体尚不可知。因此，早期检测出水体中的小普林藻，制定藻华预防策略，对防止目标水域中发生小普林藻藻华至关重要。

目前，用于小普林藻检测的方法主要分为传统的镜检法以及分子生物学方法。传统的镜检法费时费力，且需要经验丰富的专家才能进行较为准确的鉴定，在各类检测方法中并无优势。采用PCR和分子探针等分子检测技术虽具有快速、灵敏等优点，但其对实验设备的要求过高，且需要专业人员进行检测，无法实现有害藻类的野外快速检测这一目标。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA) 需要的仪器简单，耗时短，但是并非任何序列都适用于使用RPA法扩增，因此，需要找到合适的特征序列，设计合适的引物来进行RPA法扩增。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种检测水样中小普林藻的方法，包括以下步骤：

S1：提取所述水样中的DNA；

S2：通过重组酶聚合酶扩增法扩增特征位点，得到RPA扩增产物，所述特征位点的序列如SEQ ID NO:4所示；

S3：检测所述RPA扩增产物。

在一个具体实施方案中，S2中，扩增所述特征位点所用的引物序列如 SEQ ID NO:12和13所示。

在一个具体实施方案中，S2中，扩增温度为39℃，扩增时间为15min。

在一个具体实施方案中，S3中，通过横向流动测试法检测所述RPA扩增产物。

在一个具体实施方案中，在S2中扩增体系中加入了带有标签的探针， S3中使用固定了能够捕获所述标签的物质的横向流动试纸条检测所述RPA 扩增产物。

在一个具体实施方案中，所述探针的序列如SEQ ID NO:16所示，所述标签为羧基荧光素。

本发明还提供了一种用于检测小普林藻的试剂盒，包括扩增用试剂和显示用试剂，所述扩增用试剂包括用于扩增特征位点的引物组，以及与扩增产物结合探针，所述特征位点的序列如SEQ ID NO:4所示，所述探针上设置有标签，所述扩增用试剂为用于重组酶聚合酶扩增法的试剂；

所述显示用试剂包括能够捕获所述标签的横向流动试纸条。

在一个具体实施方案中，所述引物组的引物的序列如SEQ ID NO:12和 13所示。

在一个具体实施方案中，所述探针的序列如SEQ ID NO:16所示，所述标签为羧基荧光素。