[发明专利]基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用

说明书

本发明公开了基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用，通过构建并拯救PEDV嵌合病毒CHM2013‑SP_BJ、CHM2013‑S_BJ、CHM2013‑SP_BJ‑ORF3_CHM、CHM2013‑SP_BJ‑E_CHM、CHM2013‑SP_BJ‑M_CHM、CHM2013‑SP_BJ‑N_CHM和CHM2013‑(S+ORF3)_BJ，进行功能丧失性试验和功能获得性试验，得到致弱嵌合病毒CHM2013‑SP_BJ‑ORF3_CHM和CHM2013‑SP_BJ‑M_CHM，揭示了PEDV变异株BJ2011C S基因协同ORF3、E和M基因促进病毒致病，其中ORF3基因最关键。

技术领域

本发明是关于病毒基因工程的技术领域，特别是关于一种基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选弱毒疫苗的应用。

背景技术

PEDV变异株致病性增强，感染仔猪表现为水样腹泻、厌食、脱水等，对新生仔猪的致死率高达100％。与经典株相比，变异株基因组上存在四个高变区，分别为V1，V2，V3，V4。V1位于ORF1a氮端，V2位于S基因S1区域，V3包含S基因3’端和ORF3基因5’端，V4位于N基因(参见Sun M,Ma J,Wang Y,et al.Genomic and epidemiological characteristicsprovide new insights into the phylogeographical and spatiotemporal spread ofporcine epidemic diarrhea virus in Asia[J].J Clin Microbiol,2015,53(5):1484-92)。

PEDVS基因表现出遗传多样性。PEDV变异株与经典毒株相比，S基因具有特征性碱基插入及缺失。实验室构建并拯救的PEDV嵌合病毒CHM2013-SP_BJ具有致病性且能在肠道定殖，CHM2013-S_BJ丧失致病性且不能在肠道定殖，表明S基因变异是PEDV变异株致病性增强的必要非充分条件，结构蛋白协同促进病毒致病和肠道定殖。PEDV变异株S基因变异与其致病性增强的关系仍未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用，筛选出致病力低且能在肠道定殖的潜在弱毒疫苗候选株。

为实现上述目的，本发明提供了基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱方法，包括以下步骤：

S1、首先以CHM2013为骨架，构建和拯救分别置换BJ2011C结构蛋白编码区和S蛋白的嵌合病毒CHM2013-SP_BJ和CHM2013-S_BJ。再以CHM2013-SP_BJ为骨架，构建和拯救分别置换CHM2013结构蛋白的嵌合病毒CHM2013-SP_BJ、CHM2013-SP_BJ-ORF3_CHM、CHM2013-SP_BJ-E_CHM、CHM2013-SP_BJ-M_CHM和CHM2013-SP_BJ-N_CHM，进行功能丧失性试验，探究PEDV变异株BJ2011C S蛋白和其它结构蛋白协同促进致病的分子基础。