[发明专利]一种耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，涉及基因工程和遗传工程技术领域。本发明以来源于真菌Hortaea werneckii的第10家族木聚糖酶HwXyl10A为母本，采用点突变的方法，筛选到突变体N318W和D372L，两个突变体的热稳定性明显提升，且催化活力明显提升。本发明发现了影响第10家族木聚糖酶热稳定性的两个关键氨基酸残基，对第10家族木聚糖酶热稳定性改良具有重要指导意义，同时本发明为木聚糖酶的产业化生产及其在制备饲料以及生物质降解木聚糖产糖中的应用提供了依据。

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地涉及一种耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

纤维素、半纤维素、木质素和果胶是构成自然界植物生物质的主要组成成分(Wonget al., 1988)。木聚糖半纤维素中含量最高的成分，约占地球可再生有机碳的1/3，其含量仅次于纤维素。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β-1,4-糖苷键连接而成，侧链主要包括O–乙酰基、阿魏酸、香豆酸、α-L-阿拉伯呋喃糖残基和葡萄糖醛酸残基等(Squinaet al., 2009)，木聚糖酶可切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是水解木聚糖的主要酶类。

木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、啤酒酿造、造纸以及生物能源等领域（姚斌等,2011）。木聚糖酶分布在11个在糖苷水解酶家族（GH），它们是：GH5、GH 7、GH 8、GH 10、GH11、GH16、GH26、GH30、GH43、GH52 和 GH62，其中GH10家族的木聚糖酶研究报道最多，该家族木聚糖酶分子量较高，大都在35kDa以上，由于其属于(β/α)8筒状结构，因此GH10家族木聚糖酶稳定性强且底物谱广(Collins et al., 2005)。大部分微生物来源的GH10家族木聚糖酶都在中温(大约 40 到 60 ℃)中性或者微酸性环境表现出最大活力(Collins et al.,2005)。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良且催化活力高的木聚糖酶对工业生产至关重要。

蛋白质工程即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白分子结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程在酶性质改良方面应用较多，主要涉及的领域包括酶的催化效率、热稳定性、极端环境耐受性和底物特异性等。蛋白质工程主要涉及的方法有理性设计、半理性设计以及定向进化（Woodley, 2013）。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其对蛋白分子结构准确性要求较高。目前已经有超过50个微生物来源木聚糖酶的晶体结构被解析（http://www.rcsb.org/pdb/），这为木聚糖酶热稳定性改良提供了理想的结构信息。理性设计中常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方， Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶 XynA 的热稳定性和 pH 稳定性得到显著提升 (Angelicaet al., 2016)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法与引用，该发明通过定点突变得到了2种耐高温木聚糖酶突变体，是GH10家族木聚糖酶HwXyl10A中关键氨基酸位点Asn318和D372L分别突变后筛选得到的突变体，相对于盲目筛菌或人工（自然）诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。将该高比活耐热木聚糖酶突变体应用于饲料添加和生物质降解产糖产业中，具有广阔的应用前景。

一种耐高温木聚糖酶突变体，通过对木聚糖酶HwXyl10A为母本进行位点突变，得到的突变体；所述位点为Asn318或Asp372，所得突变体分别记为高比活耐热木聚糖酶突变体D318W或高比活耐热木聚糖酶突变体N372L。