[发明专利]一种重组酵母菌株及其在生物转化人参二醇型皂苷中的应用

说明书

本发明公开了一种重组酵母菌株及其在生物转化人参二醇型皂苷中的应用，属于基因工程领域。本发明的构建得到的重组毕赤酵母过表达了塔宾曲霉来源的β‑葡萄糖苷酶β‑GC，所述β‑葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.3所示；所述β‑葡萄糖苷酶具有特异性的水解人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rb3为人参皂苷Rd，且能水解人参皂苷F2为人参皂苷CK的能力。本发明制备的β‑葡萄糖苷酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

技术领域

本发明涉及一种重组酵母菌株及其在生物转化人参二醇型皂苷中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

长期以来，人参一直是世界各地高度重视的药草，可保持身体活力和延年益寿。据广泛报道，人参中的主要活性成分是人参皂甙，在抗癌、抗炎和抗氧化研究等方面有很大的应用。人参皂苷可大致分为齐墩果烷型人参皂苷(Ro等)、原人参二醇型人参皂苷(Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、CK等)和原人参三醇型人参皂苷(Re和Rf)。另外，根据去糖基化程度，人参皂苷可分为主要人参皂苷和次要人参皂苷。次要人参皂苷是通过主要人参皂苷的去糖基化获得的，在天然人参植物中不存在或非常低。此外，次要人参皂苷(F2和CK等)具有更高的生物利用度，因为它们的分子量更小，并且比主要人参皂苷具有更好的膜渗透性。目前，含有CK的片剂可作为类风湿性关节炎候选药物。

许多先前的研究都集中在使用热处理、酸碱处理或酶催化将主要人参皂苷转化为次要人参皂苷。其中，加热或酸碱处理方法对糖苷键的水解是随机的，导致产品达不到预期的药理活性。而过度的能源消耗和废物也对环境造成了严重的污染。高选择性的酶催化策略在绿色生产稀有人参皂苷方面比物理或化学制备方法具有显着优势。新型生物催化剂在绿色化学和可持续化学工程中占有重要地位，有望克服现有生物催化剂的不足。据报道，来自塔宾曲霉的胞外酶是第一个可以将原二醇性主要人参皂苷完全转化为CK的GRAS酶。同样，我们前期筛选了一个菌株A.tubingensis JE0609可以有效地将原二醇性主要人参皂苷生物转化为CK。很明显，塔宾曲霉是一种非常有价值的工业真菌，用于稀有人参皂苷的制备和天然化合物的高价值转化。据文献报道，能水解原二醇性主要人参皂苷的糖苷酶多为β-葡萄糖苷酶。因此，在人参皂苷生物转化过程中鉴定相关β-葡萄糖苷酶是发现新型高效生物催化剂和合理指导人参皂苷催化生产的关键和基础步骤。

发明内容

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母过表达了塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)来源的β-葡萄糖苷酶β-GC，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(命名为β-GC1)或SEQ ID NO.3所示(命名为β-GC2)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-GC1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-GC2的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以pPIC9K为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母GS115为表达宿主。

本发明还提供了一种重组塔宾曲霉β-葡萄糖苷酶的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先提取塔宾曲霉的RNA，将其反转录cDNA。以塔宾曲霉cDNA为模板从中采用PCR的方法扩增得到β-葡萄糖苷酶基因，克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K上，经电转化法将重组的基因导入毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌GS115中，经甲醇诱导表达获得β-葡萄糖苷酶。