[发明专利]可溶性表达的重组蛋白rP22、杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明涉及医药技术领域，具体涉及可溶性表达的重组蛋白rP22、杂交瘤细胞株及其应用。一种可溶性表达的重组蛋白rP22，所述的可溶性表达的重组蛋白rP22为重组质粒pMAL‑C5x‑p22经诱导表达获得重组p22蛋白。本发明的优点：(1)重组P22蛋白具有良好的免疫原性。(2)单克隆抗体的效价高。(3)非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体用于ASFV抗体的检测，敏感性高，特异性高，变异系数小，重复性高。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及可溶性表达的重组蛋白rP22、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASFV)是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的一种猪烈性传染病。以高热、多系统出血和高死亡率为主要特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

1921年，ASFV首次在肯尼亚报道，此后一直流行于非洲地区，1957年传播至欧洲和拉美国家。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2018年8月，我国辽宁省确诊了首例ASF疫情，随后疫情迅速扩散至全国各地，给养猪业造成了巨大的经济损失。

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前发现唯一的虫媒DNA病毒，在胞浆内复制，具有囊膜。ASFV成熟颗粒由多层结构组成，从外向内依次为囊膜、衣壳、内膜、内核衣壳和内核。ASFV基因组为双股线状DNA，全长170kb～190kb，包含151～167个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，可编码150～200种蛋白，其中有68种结构蛋白和100多种非结构蛋白。

ASFV P22蛋白由KP177R基因编码，ORF位于基因组的左端，分子量为22KDa，为病毒感染后早期诱导表达的跨膜结构蛋白，位于病毒颗粒的内膜。P22蛋白N端含一个疏水区域，带有特征性的信号肽。P22蛋白确切功能目前尚不清楚，高通量方法和蛋白质组学分析表明，P22蛋白与细胞结构、信号转导和细胞黏附等生物学过程相关的细胞蛋白相互作用，有助于吞噬作用。研究报道利用杆状病毒表达的P22蛋白具有良好的免疫原性，免疫猪后可诱导特异性的P22抗体，因此可作为血清学检测的抗原。

此外，随着ASFV在我国的流行，不断出现新的毒株，包括中等毒力、低毒力毒株、以及基因I型毒株。这些毒株感染猪后，临床症状不明显，不易察觉，持续低水平带毒排毒，且无规律，造成病原检测容易漏检，导致疾病流行，给防控带来困难。抗体检测可以发现隐蔽感染猪，对非洲猪瘟的检测显得尤为重要。OIE推荐在ASF流行疫区和低毒力ASFV感染地区进行血清学检测。2021年4月中国动物疫病预防控制中心组织开展非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒评价，旨在通过常态化抗体筛查，做好疫情监测排查。

ASFV血清学检测方法主要为ELISA方法，该方法操作简便，快捷，能进行大批量样品的检测，可适合于抗体筛查或免疫监控。OIE推荐使用的是西班牙英吉纳(INGEZIM)试剂盒，该试剂盒的包被抗原是非洲猪瘟病毒蛋白p72，利用针对p72蛋白的单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法。2021年7月中国动物疫病预防控制中心批准了33种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，均为ELISA方法，其中阻断ELISA方法12种，间接ELISA方法17种，夹心ELISA方法4种。间接ELISA方法和阻断ELISA方法均是将抗原吸附于固相载体，检测抗体。间接ELISA方法的酶标抗体是二抗，与待检抗体结合；阻断ELISA方法的酶标抗体是一抗，与抗原结合，与待测血清抗体具有相同的靶标。阻断ELISA方法采用的是纯度很高的单抗，相比间接ELISA方法具有明显的优势，一是减少了间接ELISA方法的非特异性反应，大大提高了检测的特异性，二是操作更简便、省时快捷。夹心ELISA一般是没有良好的包被抗原，选择包被抗体抓取抗原，再检测抗体，操作繁琐，且特异性一般没有阻断ELISA高。