[发明专利]一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用

说明书

本申请的实施例公开了一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用。所述获得目标蛋白的方法包括：用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：目标蛋白；在N末端的S标签；以及在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。本申请提供的方法能够实现高效的目标蛋白的胞外分泌表达，目标蛋白可以在较短时间内大量分泌表达，且可直接从培养基进行蛋白的提取或检测。

技术领域

本申请一般涉及医药技术领域，一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用。

背景技术

大肠杆菌是表达外源蛋白最常用的宿主菌之一，具有生长周期短，培养成本低，适合工业化生产等特点。但是由于它大多将外源蛋白滞留在菌体内部，导致蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性，使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐，分泌表达是解决上述问题的有效方法之一。

大肠杆菌共有五种类型的分泌系统，其中广泛用于分泌重组蛋白的主要是I型和II型分泌系统。相较于II型系统的周质表达，I型分泌系统介导的跨膜孔道直接外排更有优势，其能避免周质蛋白酶的降解，不需要破碎细胞，回收与纯化更能容易操作；另外，培养基中空间足够大，利于外源蛋白的过量表达。然而现有的I型分泌系统对外源蛋白的分泌表达效率非常低，相关研究也较少，远远达不到实际应用的需求。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本申请的一个目的是提供一种获得目标蛋白的方法，所述方法至少通过对位于融合蛋白N端的标签和C端的靶向序列进行针对性选择而使得大肠杆菌细胞具有较高的胞外分泌表达目标蛋白的水平，以快捷、高产量地生产目标蛋白。

本申请的另一目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白通过N末端的S标签以及C末端的靶向序列，使得目标蛋白可直接且高表达量地分泌至大肠杆菌胞外培养基中，无需破碎大肠杆菌菌体即可获得高表达量的目标蛋白，降低内毒素的污染以及目标蛋白在胞内的降解。

本申请的目的不限于上述目的，上述未提及的本申请的其他目的和优点可以从以下描述中进行理解，并通过本申请的实施方式更清晰地进行理解。此外，容易理解的是，可以通过权利要求中披露的特征及其组合来实现本申请的目的和优点。

具体地，本申请提供以下技术方案：

在申请的一个方面，本申请提供了获得目标蛋白的方法，包括：

用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；

其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：

目标蛋白；

在N末端的S标签；以及

在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。

在其中的一个实施例中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。

在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或多种标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。

在其中的一个实施例中，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。

在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。

在其中的一个实施例中，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。

在其中的一个实施例中，所述方法进一步包括：