[发明专利]一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法

权利要求书

1.一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）解剖黄颡鱼，分离肝脏组织，立即置于组织清洗液中，并使用组织清洗液冲洗肝脏组织；

（2）使用无菌剪刀破碎冲洗后的肝脏组织至1-3mm³大小的组织块，向组织块中加入其体积4-5倍的胶原酶Ⅳ，在恒温摇床中振荡消化，获得组织消化液；

（3）离心组织消化液，弃上清，重悬沉淀，吹打混匀后，过100μm的细胞筛网，再通过Percoll分离液进一步提纯肝细胞，经1000rpm离心10min后，收获沉淀，利用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即可获得黄颡鱼原代肝细胞；

（4）调整黄颡鱼原代肝细胞密度，28℃恒温培养黄颡鱼原代肝细胞，培养48h后更换原培养瓶中的一半培养基，继续扩大培养。

2.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述组织清洗液组成为：100ml无菌PBS溶液中加入100μl双抗青霉素-链霉素溶液，磁力搅拌器充分混匀后使用。

3.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述胶原酶Ⅳ是Servicebio，其使用浓度为1mg/ml，消化条件为26-28℃、100rpm震荡消化30-40min。

4.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（3）中，DMEM完全培养基为100ml DMEM中含有15%体积的胎牛血清，2%体积的黄颡鱼血清和1%体积的双抗青霉素-链霉素溶液。

5.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（4）中，调整黄颡鱼原代肝细胞密度至10⁴cells/ml-10⁵cells/ml。