[发明专利]一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法

说明书

本发明公开了一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法；包括以下步骤：无菌解剖并分离黄颡鱼肝脏组织，立即置于组织清洗液中冲洗；将清洗后的肝脏剪碎，加入胶原酶Ⅳ，恒温震荡消化组织块；离心组织消化液，重悬沉淀，过筛，并进一步经分离液离心提纯后，使用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素‑链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即获得黄颡鱼原代肝细胞，调整细胞密度后铺瓶培养；本发明黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，操作步骤简单，使用的酶试剂少，分离后肝细胞得率高，经原代培养后，肝细胞生长状态好，生理状态稳定，为后续黄颡鱼肝细胞系的建立和细胞层面科学研究的开展提供了理论和技术支持。

技术领域

本发明属于鱼类细胞离体培养技术领域，具体涉及一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法。

背景技术

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲇形目，鲿科鱼类，在我国长江、黄河、珠江及黑龙江等流域均有分布。黄颡鱼因其肉质鲜嫩、脊间刺少等特点，深受消费者的喜爱，养殖规模逐年扩大，已成为我国重要的淡水养殖经济鱼类。然而随着产业的迅速发展，养殖过程中如病害频发、种质退化等问题也逐渐凸显，造成巨大经济损失。深入解析黄颡鱼相关分子机制，对促进可持续绿色健康养殖具有重要意义。

肝脏作为鱼类的重要器官，在代谢调节和免疫防御方面发挥双重功能，对维持鱼体内环境稳态和响应病原体感染起到关键作用，具有重要的研究价值。原代培养的肝细胞离体时间短，较好地保留和维持活体肝细胞的功能组成，是建立体外模型和研究细胞水平分子调控机制的重要手段。因此，发明黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，是开展基础理论研究的关键前提。但现有鱼类肝细胞分离和原代培养技术存在操作步骤较为繁琐，细胞分离后得率不够高，以及在黄颡鱼中适用性较差的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，包括以下步骤：

（1）解剖黄颡鱼，分离肝脏组织，立即置于组织清洗液中，并使用组织清洗液冲洗肝脏组织；

（2）使用无菌剪刀破碎冲洗后的肝脏至1-3mm³大小的组织块，向组织块中加入其体积4-5倍的胶原酶Ⅳ，在恒温摇床中振荡消化30min，获得组织消化液；

（3）离心组织消化液，弃上清，利用DMEM完全培养基重悬沉淀，吹打混匀后，过100μm的细胞筛网，再通过Percoll分离液进一步提纯肝细胞，经1000rpm离心10min后，收获沉淀，利用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即可获得黄颡鱼原代肝细胞；

（4）调整肝细胞密度，28℃恒温培养黄颡鱼原代肝细胞，培养48h后更换原培养瓶中的一半培养基，继续扩大培养，获得黄颡鱼原代肝细胞。

进一步地，步骤（1）中所述组织清洗液组成为：100ml无菌PBS溶液中加入100μl双抗青霉素-链霉素，磁力搅拌器充分混匀后使用。

进一步地，步骤（2）中所述胶原酶Ⅳ是Servicebio，其使用浓度为1mg/ml，消化条件为26-28℃、100rpm震荡消化30-40min。

进一步地，步骤（3）中，DMEM完全培养基为100ml DMEM中含有15%体积的胎牛血清，2%体积的黄颡鱼血清和1%体积的双抗青霉素-链霉素溶液，其中青霉素和链霉素的浓度分别为100Units/ml和100μg/ml；pH为7.0-7.4。

进一步地，步骤（4）中，调整黄颡鱼原代肝细胞密度至10⁴cells/ml-10⁵cells/ml。

本发明的有益效果为：