[发明专利]一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法

权利要求书

1.一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)受试物的制备：用完全培养液2将受试物配制成一定浓度的受试物溶液，备用；

(2)HaCaT细胞的培养：一定条件下对HaCaT细胞进行培养，得到HaCaT细胞培养液，备用；

(3)抗衰老活性检测：将步骤(1)所得受试物溶液加入步骤(2)中的HaCaT细胞培养液中，一定条件下进行培养；

(4)抗衰老活性评价：培养结束后，吸出培养液，加入二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以490nm的波长处分别测定其吸收度A值，按照下式进行计算增殖指数：

通过在某浓度范围内增殖指数与细胞对照组是否有显著性差异来评价抗衰老活性；

通过MTT溶液检测细胞增值率。

2.根据权利要求1所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养液为RPMI-1640培养液。

3.根据权利要求1所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述HaCaT细胞的培养具体包括以下步骤：

用完全培养液1培养HaCaT细胞至对数增长期；

用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加完全培养液2稀释至每1ml中含5*10⁴～1*10⁵个细胞，得到细胞悬液；

将上述细胞悬液在多孔细胞板上铺板，其中留3孔加10％新生牛血清培养液作为空白对照，置于37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使其贴壁。

4.根据权利要求3所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，所述完全培养液1的配制方法为：取含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基900ml，加已灭活的新生牛血清100ml；

所述完全培养液2的配制方法为：取不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养基900ml，加已灭活的新生牛血清100ml；

所述0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液的配制方法为：取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，-20℃保存。

5.根据权利要求1所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(3)中，受试物组：每孔加受试物溶液，每个浓度均做3孔；细胞对照组和空白对照组：每孔分别加RPMI-1640培养液。

6.根据权利要求5所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养条件具体为：置于37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束前4小时取出培养板，吸取培养液，每孔加入pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗一次，然后再在每孔中加入完全培养液2配制的0.5mg/ml MTT工作液，继续培养。

7.根据权利要求6所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，所述MTT工作液的配制方法为：取MTT 50mg，加0.01mol/L不含钙镁的磷酸盐缓冲液10ml溶解后，制成5mg/ml的MTT储存液，过滤除菌，保存于冷处，使用不超过二周。临用前用完全培养基2稀释成0.5mg/ml的MTT工作液。

8.根据权利要求1所述的用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，其特征在于，步骤(4)中，用统计学软件进行统计和显著性分析，P＜0.05表示具有显著性差异；受试物组与细胞对照组相比，增殖率＞100％，且经t检验P＜0.05，可判定受试物具有抗衰老功效。