[发明专利]一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法

说明书

本发明属于化妆品新原料的功效评价技术领域，尤其涉及一种用于β‑烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法。本发明采用一种能模拟人表皮细胞的细胞株系—HaCaT细胞，采用一种更简便的体外细胞评价方法来评价β‑烟酰胺单核苷酸的抗衰老功效，符合实验动物3R原则。采用简便低成本的MTT方法来对细胞进行增殖力检测，优化了试验条件，并通过将受试物孵育培养基和细胞培养基区分开来，提高了检测重复性，解决了β‑烟酰胺单核苷酸使用常规细胞增殖检测试验体系进行抗衰老活性评价检测结果不理想的问题。构建了一种快速、低成本的β‑烟酰胺单核苷酸体外抗衰老活性评价方法。

技术领域

本发明属于化妆品新原料的功效评价技术领域，尤其涉及一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法。

背景技术

2009年-2019年这10年里，我国获批上市的化妆品新原料只有4个，自2021年《化妆品监督管理条例》实施后，化妆品新原料的成功备案取得了突破性进展。2021年5月1日，为贯彻落实《化妆品监督管理条例》，规范和指导化妆品功效宣称评价工作，国家药监局宣布施行《化妆品功效宣称评价规范》(以下称《规范》)，要求应当依据《规范》的要求对化妆品的功效宣称进行评价。但并未规定具体的功效评价方法，也没有相应的标准规范。

β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide)，简称“NMN”，是一种自然存在的生物活性核苷酸，可作为化妆品原料添加，是细胞保持活力的重要支撑，具有抗衰老的重要功能。自2022年1月份首家公司的β-烟酰胺单核苷酸获批化妆品新原料以来，已有三家公司的β-烟酰胺单核苷酸作为化妆品新原料备案成功。对该原料进行全面快速的风险评估和评价成为推动备案的重要因素。除了理化和安全性检测外，对该原料的功效评价也成为了在新原料备案过程中亟需解决的问题。对于抗衰老体外评价方法，目前现有技术中通过对抗氧化性、防晒性辅助进行评价，采用的方法包括紫外扫描法、紫外吸光度法DPPH、自由基清除试验等化学方法和L929成纤维细胞细胞周期检测、凋亡检测、B16黑色素瘤增殖力检测等体外细胞方法，以及动物试验评价方法。然而，上述现有技术中的方法存在不够直观，重复性差、操作相对复杂等问题。根据化妆品功效宣称评价项目要求，抗衰老功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价，相较于其它两种技术方法，建立合适的实验室体外评价方将极大地推动备案进程，更符合人体伦理。此外体外试验室方法具有用时短、成本低、可用于广泛初筛等优点。

人角质形成细胞，是构成表皮的主要细胞成分，是由于外胚层分化而来。角质形成细胞通过细胞间桥紧密连接在一起。角质形成细胞的特征为在分化过程中可产生角蛋白，能够连续不断地分化与增殖，从而使新生的细胞与脱落的角质细胞维持平衡，以维持表皮正常厚度，延缓衰老。对皮肤生物学研究发现，延长角质形成细胞的增殖倍数，加速其增殖，能够有效抑制皮肤衰老。故而人角质形成细胞可以作为化妆品及原料抗衰老功效评价的有效模型，通过受试物孵育后检测细胞的增殖率的变化，来评价受试物对人角质形成细胞增殖的影响，从而评价化妆品或化妆品原料的抗衰功效。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，本发明采用一种商业化的细胞株系-人角质形成细胞(HaCaT)来构建体外评价模型，通过优化试验条件，对细胞增殖力进行测定来评价β-烟酰胺单核苷酸的抗衰老功效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性评价的体外检测方法，具体操作步骤如下：

(1)受试物的制备：用RPMI-1640培养液配制成不同浓度的受试物溶液。

(2)HaCaT细胞的培养：

用完全培养液1培养HaCaT细胞至对数增长期；