[发明专利]一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法

说明书

本发明公开了一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，该方法包括以下步骤：将含有系列浓度标志蛋白的样品与适配体孵育，将所得产物与Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针孵育，孵育产物使用激光激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；将含有未知浓度标志蛋白的样品进行同样的分析，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度。与现有ELISA方法相比，本发明方法具有更高灵敏度，催化效率更高。

技术领域

本发明涉及一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法。

背景技术

成簇的规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)相关(Cas)系统最早在古细菌和细菌中被发现，是一组适应性的免疫系统，天然的保护这些生物体免受侵入性遗传成分(如病毒和具有感染能力的质粒等)的侵入。与一种或多种Cas蛋白结合使用后，CRISPR RNA(crRNA)能够识别特异性的核酸序列，激活Cas蛋白发挥核酸内切酶功能，对靶标核酸分子进行剪切。

除了特异性核酸内切酶活性(靶向切割)外，CRISPR类型中的III、V和VI RNA引导的核酸酶(Cas12、Cas13和Cas14)还具有侧链靶向激活的非特异性单链核酸水解酶活性(侧链切割)，这使它成为核酸的重要检测工具。由于具有高特异性，以及引导RNA的设计较为简单，CRISPR/Cas系统越来越广泛的被用于与侧向层析试纸条或荧光传导系统进行联用从而对核酸进行检测。

表面增强拉曼效应(Surface Enhancement of Raman Scattering,SERS)是一种基于拉曼散射鉴定生物和化学分析物的高灵敏度和选择性的工具。主要表现为拉曼探针在某些特殊制备的金属导体表面特别是粗糙的贵金属表面(如金、银等)或溶胶中(这些物质被统称为拉曼基底)，在激发区域内，由于拉曼探针与拉曼基底表面或近表面的电磁场发生共振，使得拉曼散射信号远比普通的拉曼信号大大增强的现象。

SERS作为一种新兴的光谱方法，由于其独特的高灵敏度、高分辨率和稳定性的特点，以及具有高特异性的单分子特征峰，已被广泛应用于有机污染物分析、重金属离子检测、蛋白质测量等领域。随着拉曼光谱的快速发展和疾病诊断的迫切需要，SERS已广泛应用于生物分析和生物医学研究。

但是，现有的标志蛋白检测方法存在负向信号、操作繁琐、检测成本高的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，提高了检测的灵敏度、特异性和催化效率，具有操作简便、检测周期短的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表面增强拉曼效应与CRISPR/Cas12a联用的蛋白检测方法，包括以下步骤：

(1)将含有系列浓度标志蛋白的样品与适配体在缓冲液中至少孵育30分钟，得到标志蛋白结合适配体的样品，将所得样品与Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针至少孵育20分钟，孵育产物使用激光(785nm)激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰(1074cm^-1)并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；

在步骤(1)中，crRNA是识别适配体的，而适配体是特异性识别待测蛋白(标志蛋白)并缠绕在其上面；如果适配体缠绕在蛋白上，将不能被crRNA识别；反之，当不含待测蛋白时，crRNA特异性识别适配体，从而激活Cas12a的酶活性，随后对ssDNA进行任意切割。

拉曼探针包括三个部分：磁珠、偶联了拉曼分子的胶体银、将前面两个部分连接起来的ssDNA。若ssDNA被剪切，经过磁吸附、清洗后、偶联了拉曼分子的胶体银会被洗去，因此会发生拉曼信号的变化。