[发明专利]一种胡椒2-链烯还原酶、编码基因及应用

说明书

本发明涉及一种来源于胡椒的2‑链烯还原酶及其编码基因，以及该2‑链烯还原酶在微生物催化制备四氢胡椒碱中的应用。所述胡椒2‑链烯还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种可催化制备四氢胡椒的2‑链烯还原酶及其编码基因，利用该酶以胡椒碱为反应底物，可实现四氢胡椒碱的高效制备。

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于胡椒的2-链烯还原酶及其编码基因，以及该2-链烯还原酶在微生物催化制备四氢胡椒碱中的应用，属于酶催化技术领域。

(二)背景技术

四氢胡椒碱是来源于胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的干燥近成熟或成熟果实的一种活性成分，其具有抗惊厥、抗癫痫和镇痛等功效。此外，四氢胡椒碱还是一种高效、安全和天然的植物促渗透剂，可以通过增加脂质双层的流动性和增加药物分子或营养物质与细胞膜的亲和力，从而促进皮肤组织对一些有效活性成分的吸收利用，被广泛运用于食品、药品和化妆品等领域，用以提高营养成分、有效成分和功能性成分的吸收和利用。四氢胡椒碱在胡椒中的产量较低，提取难度大，因而价格较高，而胡椒碱也是从胡椒的干燥近成熟或成熟果实中提取获得，其含量可占胡椒果实的4％～9％，价格相对较低，其结构与四氢胡椒碱相似。因此，通过对胡椒碱进行氢化反应即可获得四氢胡椒碱。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种来源于胡椒的2-链烯还原酶及其编码基因，以及该2-链烯还原酶在微生物催化制备四氢胡椒碱中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种胡椒2-链烯还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明在胡椒中发现一条2-链烯还原酶基因Pnaer，其表达的蛋白可以催化胡椒碱生成四氢胡椒碱。利用胡椒2-链烯还原酶催化制备四氢胡椒，可大大降低四氢胡椒碱的成本。

本发明还涉及编码所述的胡椒2-链烯还原酶的基因。

具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及含有编码所述胡椒2-链烯还原酶的基因的重组载体。

本发明还涉及含有所述胡椒2-链烯还原酶的基因的基因工程菌。

本发明还涉及所述胡椒2-链烯还原酶在微生物催化制备四氢胡椒碱中的应用。

本发明还涉及一种利用胡椒2-链烯还原酶制备四氢胡椒碱的方法，所述方法为：以胡椒碱为反应底物，以转入SEQ ID NO.1所示胡椒2-链烯还原酶基因的基因工程菌发酵后的发酵液经过细胞破碎得到粗酶液作为催化剂，在pH6.0～8.0、温度25～50℃条件下反应2～48h，于反应液中获得四氢胡椒碱。

进一步，所述反应可加入辅酶NAD(P)H和NAD(P)⁺，在辅酶循环系统中进行，所述辅酶循环系统为醇脱氢酶/异丙醇、甲酸脱氢酶/甲酸盐或葡萄糖脱氢酶/葡萄糖系统。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种可催化制备四氢胡椒的2-链烯还原酶及其编码基因，利用该酶以胡椒碱为反应底物，反应12h，胡椒碱转化率大于85％，最高产物四氢胡椒碱浓度达到13.23g L^-1，可实现四氢胡椒碱的高效制备。

(四)附图说明

图1为胡椒2-链烯还原酶催化胡椒碱生成四氢胡椒碱的反应示意图。

图2为胡椒2-链烯还原酶基因核酸胶图。

图3为胡椒2-链烯还原酶系统进化树。

图4为SDS-PAGE分析胡椒2-链烯还原酶。

图5为四氢胡椒碱酶促反应产物HPLC检测结果。

(五)具体实施方式