[发明专利]重组腺相关病毒载体制品中游离和错误包装DNA的检测方法

说明书

本发明提供一种检测重组腺相关病毒(rAAV)载体制品中载体外的游离DNA和/或错误包装DNA的含量的方法。

技术领域

本发明涉及生物制药领域中用于质控的杂质检测方法，具体涉及用于检测重组腺相关病毒(rAAV)载体制品中的DNA杂质的方法。

背景技术

重组腺相关病毒(recombinant-adeno-associated virus，rAAV)载体为由腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)改造而来的载体。rAAV结构简单、无致病性，可感染分裂期/非分裂期细胞，具有不整合至基因组等优势，是目前基因治疗中应用较多的病毒载体之一。

rAAV的生产会采用多个质粒并利用宿主细胞，因此在生产过程中会引入不属于AAV载体的核酸物质。例如，在采用3质粒系统(Helper-free AAV包装系统)瞬转宿主HEK293细胞而包装出病毒时，在病毒的包装过程中会产生错误包装了作为宿主的HEK293细胞的宿主细胞DNA(Host Cell DNA，HCD)和质粒DNA的情况。另外，在rAAV的纯化步骤中，在产物中也会或多或少地存在未被除去的游离DNA，如游离的HCD和质粒DNA。

在生物制品的质量控制中，准确测定各种状态的DNA杂质的含量非常重要。对于rAAV产品而言，准确检测错误包装的DNA以及游离DNA这两大类“杂质”对于确定产品的最终质量非常重要。另一方面，如果能够区别性检测不同来源的杂质，例如分别定量宿主细胞DNA和质粒DNA，对于了解并优化生产过程可能也是有意义的。因此，急需一种能够准确检测rAAV产物中这两类DNA杂质含量的方法。

采用非特异性结合DNA的荧光染料法是一种检测DNA杂质的方法。由于缺乏特异性，无法区分杂质的类别，也不便于检测位于病毒内部的错包DNA。

在目前常用的工艺中，通常仅着眼于如何去除游离DNA。例如，通常可使用超滤离心去除游离于病毒外的DNA，其中会选用合适的超滤管来分离病毒与游离DNA。然而，超滤离心法无法将吸附在病毒上的游离DNA分离，仍然会有部分未被包装的DNA残留在病毒产品上，因而即使能够对去除的游离DNA进行定量，其结果也不能精确地检测产品中的游离DNA含量。另一方面，这种方法也无法测定错误包装的DNA的含量。

另一种常用于去除杂质DNA的方法是使用核酸酶。CN105420201A记载了一种使用全能核酸酶去除疫苗产品中作为生产宿主的Vero细胞DNA的方法。该技术手段目前也局限于在病毒纯化步骤中大量地去除宿主DNA，并未扩展至残留杂质检测领域。对于已经经历过纯化过程的产物而言，不能确定该方法是否能够有效去除产物中含量低得多的宿主DNA杂质，从而用于精确检测产品中残留的DNA杂质。采用Vero细胞生产疫苗的过程也不涉及质粒的使用，相应地也就没有涉及质粒DNA杂质的讨论。

另外，CN 113980956 A和CN 112481254 A描述了使用核酸酶处理以去除宿主核酸以便富集目标微生物或病原体的DNA的方法。一方面，这两篇专利申请不涉及病毒生产工艺，特别是rAAV生产工艺，不涉及质粒的使用，相应地也不关注质粒DNA与宿主DNA的区别。另一方面，这两篇申请不涉及检测，而是一种纯化手段。

以上方法均未提供对游离DNA和错误包装DNA杂质这两类杂质的分类检测和定量，也没有针对rAAV生产提供区分性检测来源于宿主细胞DNA和质粒DNA的杂质DNA的方法。另外，现有技术也没有针对经过纯化的样品，提供能够差异性检测和定量不同类别杂质DNA的方法。

因此，仍然需要一种适用于rAAV生产工艺中的定量检测游离DNA和错误包装DNA的方法，并且希望该方法还能够检测不同来源的杂质DNA，例如来源于宿主细胞DNA和质粒DNA的杂质DNA。

发明内容