[发明专利]一种IPSC培养体系及IPSC残留检测的方法

说明书

本发明涉及一种IPSC培养体系及IPSC残留检测的方法,所述IPSC培养体系包括基础培养基，所述基础培养基中添加胰岛素、抗坏血酸2‑磷酸盐、转铁蛋白、亚硒酸钠、NaHCO₃、FGFb、TGFβ和Harmine。本发明优化了培养体系成分，不必同时使用层粘连蛋白和Essential8培养基，在保证单个IPSC存活率不受影响的情况下，能够最大限度维持单个IPSC不分化，提高未分化IPSC的干性，还可以降低检测下限，提高检测灵敏度，本发明的检测灵敏度可达0.0005％，且同时能够缩短检测时间，利用本发明的培养体系培养4天即可实现对IPSC残留的检测。

技术领域

本发明涉及一种IPSC培养体系及IPSC残留检测的方法，属于未分化IPSC检测领域。

背景技术

多能干细胞(PSC)，例如胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(IPSC)，是一种可以分化为体内任何细胞类型的多能干细胞。PSC衍生疗法在有效治疗许多人类疾病方面具有巨大的前景，可能为各种威胁生命的疾病提供治愈性的医疗解决方案，包括癌症、心血管、代谢、免疫系统和神经系统疾病。然而，在这些潜在转化疗法的开发中，一个关键的安全问题是残留的未分化PSC可能会持续存在于最终的细胞疗法产品中，这可能会导致畸胎瘤或其他肿瘤。监管机构要求对残留未分化PSC水平进行质量控制(QC)的安全测定，以确认最终产品的纯度。

检测下限是体外安全性QC测定需要考虑和解决的关键问题，以检测用于PSC衍生细胞疗法的残留未分化PSC。在这个领域的发展中，检测灵敏度要求仍很重要。目前的共识似乎是检测应该能够以至少0.001％的灵敏度检测残留的未分化PSC水平，即在1×10⁶个衍生细胞的背景中检测到10个PSC。鉴于PSC具有相对较高的肿瘤形成固有风险，0.001％的灵敏度仍然不能满足要求。

目前，已经开发了各种测定方法来体外检测衍生细胞疗法中残留的未分化IPSC，例如流式细胞仪、定量实时PCR(qRT-PCR)分析、数字PCR、miRNA靶标和高效培养系统，其中，流式细胞仪的检测原理是对IPSC来源的功能细胞中的2-3个干细胞特异性基因进行流式检测，得到IPSC残留的比例；定量实时PCR(qRT-PCR)分析、数字PCR、miRNA靶标的检测原理是对IPSC来源的功能细胞中的2-3个干细胞特异性基因进行定量实时PCR(qRT-PCR)分析、数字PCR、miRNA靶标分析，得到IPSC残留的比例；高效培养系统的检测原理是使用干细胞培养基，扩大培养IPSC来源的功能细胞，对扩大培养后的细胞，使用2-3个干细胞特异性基因进行定量实时PCR(qRT-PCR)分析、数字PCR、miRNA靶标分析，得到IPSC残留的比例。高效培养系统需要10到14天的检测时间，存在检测效率低、耗时长的问题，同时，该方法会存在会有残留的IPSC自分化产生假阴性的可能，通过对细胞进行扩大培养的检测方式，还存在过低的浓度细胞不易成活的问题。除高效培养系统外，这些测定方法中的大多数都是基于检测未分化的细胞标志物的表达来进行检测的，以上方法仅仅只能对3个左右的标记物进行检测，因此存在假阴性高的问题。

本申请人前期开发出“一种基于单细胞测序数据分析的IPSC残留检测方法”(CN113355433A)，该方法基于单细胞测序技术，对每一个IPSC来源的功能细胞进行单细胞mRNA测序，结合生物信息学分析，在全基因转录组水平上分析IPSC残留，灵敏度能够达到0.001％。