[发明专利]一种基于CRISPR系统的核酸双指标快速检测试纸条及工作方法

说明书

本发明涉及分子检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR系统的核酸双指标快速检测试纸条及工作方法，试纸条包括双标记结合垫和设置有质控线、第一检测线及第二检测线的硝酸纤维素膜，双标记结合垫上设置有鼠源抗体‑标记载体偶联物和兔源抗体‑标记载体偶联物。本发明通过采用CRISPR与侧向层析试纸结合的形式，操作便捷，检测速度快，5～15min便可实现待检测核酸靶标的可视化检测。本发明通过设置双标记探针、双标记结合垫和质控线、第一检测线和第二检测线，实现了核酸双指标的同时检测，极大地提升了检测效率。

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体领域为一种核酸双指标快速检测试纸条。

背景技术

CRISPR分子检测是2017年由博德研究所张锋团队首先开发出来的新型分子检测技术，主要原理是利用Cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测探针序列被切割情况从而判读结果的一种检测方法(Gootenberg,Jonathan,S,et al.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.[J].Science,2017.)。

2019年，该研究团队将CRISPR方法和侧向层析试纸结合起来推出了SHERLOCK技术(Kellner M J,Koob J G,Gootenberg J S,et al.SHERLOCK:nucleic acid detectionwith CRISPR nucleases[J].Nature Protocols,2019,14(10))。该方法在系统中引入了两端分别标记生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC)的探针序列。采用的侧向层析试纸条可以检测同时含有Biotin和FITC的序列：在近端的条带处包被有可结合Biotin的链霉亲和素(streptavidin，SA)，在胶体金上标记有抗FITC抗体，另外远端还有一条条带，包被有可与抗FITC抗体结合的二抗。这是一种夹心法的试纸条，当样品中存在同时含有Biotin和FITC的序列时，会在近端的条带处形成SA-Biotin-探针-FITC-抗FITC抗体-胶体金复合物，从而显色。

该研究团队将该夹心法试纸条用竞争法方式使用。样本为阴性时，CRISPR系统未激活，修饰有Biotin和FITC的探针序列不会被切割，探针保持完整，胶体金全部被试纸条近端的SA条带处通过夹心法被完全捕获，不会到达试纸条远端的线。

当样本为阳性时，两端分别标记有Biotin和FITC的探针序列被切断，从而使部分胶体金越过近端条带到达远端条带，呈现为阳性结果。

但是，该试纸条的设计无法进行多指标的联合检测。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种检测速度快、操作便捷的基于CRISPR系统的核酸双指标快速检测试纸条及工作方法。

目前，CRISPR核酸检测技术正处于发展期，欧洲、美国以及中国的核酸检测的要求均是双靶标，一个作为内参指标，一个作为检测指标。但是，由于CRISPR技术是一个信号放大系统，在Cas12酶启动后，对于ssDNA是一种无差别的切割；Cas13启动后，对于ssRNA是一种无差别的切割。这样在设计双靶标的时候，只能采用Cas12和Cas13双系统的策略。而本发明的研发正是为了配合CRISPR的双系统显色的研发。目前国内外尚未出现配合CRISPR双系统显色的核酸试纸条。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于CRISPR系统的核酸双指标快速检测试纸条，所述试纸条包括双标记结合垫和设置有质控线、第一检测线及第二检测线的硝酸纤维素膜。

进一步的，所述双标记结合垫上设置有鼠源抗体-标记载体偶联物和兔源抗体-标记载体偶联物。

进一步的，所述鼠源抗体-标记载体偶联物包括鼠抗FITC抗体-标记载体偶联物。