[发明专利]牡丹枝孢霉的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用

权利要求书

1.一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一、筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物，所述LAMP特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3；

步骤二、建立LAMP反应体系并扩增目标DNA，具体方法为：将2.5 μL 10×ThermoPolBuffer、0.16 U/μL Bst DNA聚合酶、1 mmol/L dNTP、8 mmol/L MgSO₄、0.2 μmol/L F3/B3、0.6 mol/L 甜菜碱、1.6 μmol/L FIP/BIP、0.15 mmol/L HNB、1 μL模板DNA，ddH2O补至25 μL混匀后放入水浴锅中反应，反应温度为60-68 ℃，反应时间为57-63 min；

步骤三、将步骤二中的扩增目标DNA进行红斑病菌的特异性检测以诊断出牡丹红斑病。

2.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤一中LAMP特异性引物的筛选方法：利用MEGA软件对牡丹红斑病菌的ITS基因序列以及牡丹黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、黄斑病菌、灰霉病菌的ITS基因序列进行比对分析，从中筛选出红斑病菌与其他病菌序列同源性低的片段，并将获得的基因片段在在线软件上设计针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物。

3.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤二中扩增结束后通过观察PCR管的颜色变化以及2%琼脂糖凝胶电泳结果来判断扩增反应是否进行。

4.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤二中模板DNA为牡丹红斑病、牡丹黄斑病、牡丹灰霉病、牡丹黑斑病的总DNA。

5.根据权利要求1所述一种牡丹红斑病菌的检测方法，其特征在于，所述步骤三中的LAMP反应的特异性检测的方法为：设置阴性对照，在LAMP反应体系中加入与其他处理组模板等量的ddH₂O代替，将LAMP反应体系进行LAMP反应的特异性检测。

6.一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用，其特征在于，通过权利要求1-5任一项所述牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病早期和中后期的诊断。

7.根据权利要求6所述一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用，其特征在于，所述油用牡丹红斑病早期诊断检测：采集类似牡丹红斑病的发病叶片，将发病部位剪下，60-70℃恒温水浴9-11min后，10000rpm离心8-12min，取上清液作为LAMP反应的模板DNA，以添加等量ddH₂O的处理作为阴性对照，同时以红斑病菌基因组DNA为阳性对照，进行发病叶片的LAMP检测，LAMP反应结束后，结合离心管颜色反应及凝胶电泳条带，判断发病叶片是否为红斑病。

8. 根据权利要求6所述一种牡丹红斑病菌的检测方法在油用牡丹红斑病诊断的应用，其特征在于，所述油用牡丹红斑病中后期诊断检测：选取病斑上有明显霉层的病叶，用单面刀片从病斑上刮取病菌的菌丝等病征，放入2mL离心管中，加200 μL ddH₂O后置于60-70 ℃水浴锅中水浴5-10 min，然后10000 rpm离心8-12 min，吸取上清液做为模板DNA，以添加等量ddH₂O的处理作为阴性对照，进行发病叶片的LAMP检测，LAMP反应结束后，结合离心管颜色反应及凝胶电泳条带，判断发病叶片是否为红斑病。