[发明专利]牡丹枝孢霉的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用

说明书

本发明属于油用牡丹红斑病检测诊断技术领域，具体涉及牡丹红斑病的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用。将筛选出针对牡丹红斑病菌的LAMP特异性引物直接用于建立的LAMP反应体系中并扩增目标DNA，通过目标DNA的凝胶电泳条带进行红斑病菌的特异性检测和LAMP颜色反应的特异性检测诊断出牡丹红斑病。本发明建立的LAMP检测体系，对于发病早期无明显病征以及中后期有明显病征的病叶，均能灵敏地实现对红斑病的诊断。

技术领域

本发明属于油用牡丹红斑病检测诊断技术领域，具体涉及牡丹红斑病菌的检测方法及在油用牡丹红斑病诊断上的应用。

背景技术

类似于人生病时去医院看病，医生需要通过各项指标来判断病因及疾病种类。植物病害诊断也是需要通过各种方法，鉴定病原物的种类，进而对植物病害做出诊断，并建议生产中的施药选择。而除了白粉病、锈病、霜霉病、黑粉病等病征和病状典型的病害，依据发病部位的病状和病征可以直接作出判断；对于大部分病害，尤其是叶斑类病害，病征很少，即使有病征，也往往仅有菌丝而无孢子，依据发病部位形成的病征很难作出准确判断。往往需要将病菌从发病部位进行分离，依据分离出的病菌在培养基上产生的菌落、形成的孢子及产孢结构等，作出准确判断；而某些病菌如果不产孢，则需培养后提取DNA，进行DNA特异性片段特异性扩增后测序，依据序列结果进行BLAST序列比对，确认病菌归宿。

随着分子生物学技术的进步，尤其是聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction，PCR）的普及，人们尝试采用普通PCR技术来对植物病害进行快速诊断。操作步骤如下：从发病组织中提取DNA，然后依据疑似的病原菌的保守序列设计引物，进行PCR扩增反应；扩增出条带后，送至生物公司测序；将所获得的序列在NCBI网站上比对，依据得分高低判断病菌归属。

相比于传统的病菌形态特征诊断结合病菌的分离，借助于普通PCR的植物病害的分子诊断具有测定结果准确、不受病菌是否产孢等因素影响。但该技术需要昂贵的PCR仪；且由于需要进行病原菌基因组保守序列搜索、比对等，对操作人员要求较高，在生产中推广应用难度较大。

牡丹不仅因其花大而香、花色艳丽而具有极高的观赏价值，而且根部含有抗菌消炎物质——丹皮酚，籽粒中含有42%以上的α-亚麻酸、92%以上的不饱和脂肪酸等数十种营养成分，使牡丹同时具有很高的药用和食用价值。

由牡丹红斑病菌引起的红斑病是牡丹上发病最严重的病害之一，发病严重时可导致牡丹叶片干枯变黄，植株生长势变弱、产籽量减少，花色衰退等，对切花牡丹、观赏牡丹以及油用牡丹的产业化发展带来巨大的威胁，造成严重的经济损失。牡丹红斑病主要危害茎和叶片，也能侵染叶柄、嫩叶和枝。一般下部叶片最先感病，叶片发病初期叶正、背面出现绿色针头状小点，以后扩展为直径 3～12mm 的紫褐色近圆形的病斑，中央淡黄褐色，边缘暗紫褐色，30d 后可扩展成10～30mm大小的病斑，有的病斑相连成片，大多数病斑有明显的同心轮纹，在病斑上呈现不整齐淡褐色轮状环纹和霉状物。在潮湿的气候条件下，病斑背面常生墨绿色或灰褐色霉层，似绒毛状，为病菌的菌丝和分生孢子梗。当病害侵染茎时，茎上出现紫褐色长圆形的病斑小点，稍隆起，病斑扩展缓慢，后期病斑长径仅为 3～5mm；病斑中间开裂并下陷，严重时病斑相连成片，潮湿时病部也产生霉层，常导致嫩枝枯死。叶柄、叶脉感病后，症状与茎相同。萼片与花瓣上病斑开始均为褐色小点，严重时边缘枯焦。

牡丹红斑病与多种牡丹病害常常混合发生，且发病初期症状不明显，不易区分，故无法及时采取措施来控制病害的发生。因此建立一种能够在红斑病发病初期诊断检测病害的方法，对于红斑病的早期监测与防控具有重要意义。