[发明专利]一种基于气相色谱-串联质谱快速测定微量人血清中尼古丁和可替宁的方法

说明书

本发明公开了一种基于气相色谱‑串联质谱快速测定微量人血清中尼古丁和可替宁的方法，包括：取15～100μL血清，加入5～50μL氘代同位素内标溶液混匀，再加入45～300μL甲醇，充分涡旋，离心，取上清液进行气相色谱‑串联质谱检测；根据定性离子对和保留时间对尼古丁、可替宁进行定性；将尼古丁或可替宁的定量离子的峰面积与氘代同位素内标的峰面积的比值分别代入尼古丁或可替宁的基质匹配内标标准曲线，获得尼古丁和可替宁的浓度。本发明仅需微量血清样品，基于特定的毛细管柱有效分离尼古丁和可替宁，利用优化的串联四级杆监测参数，就可以准确、灵敏、省时、高效的获得尼古丁和可替宁残留数据，且成本低。

技术领域

本发明涉及一种人血清中污染物及其代谢产物的检测方法，具体涉及一种基于气相色谱-串联质谱快速测定微量人血清中尼古丁和可替宁的方法。

背景技术

吸烟与健康是世界范围内最受关注的公共卫生问题之一。尼古丁(式Ⅰ，分子式：C₁₀H₁₄N₂)及其代谢产物可替宁(式Ⅱ，分子式C₁₀H₁₂N₂O)的人体残留是反映个体吸烟状态的重要标志物。血清是测定尼古丁及可替宁残留的理想生物样本，但样本收集时取样量有限。

血清中痕量尼古丁和可替宁的常用分析方法有气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。气相色谱法和液相色谱法灵敏度低、定性能差，对血清样本的需求量大(约1～2mL)，且样本需经蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取、氮吹浓缩等复杂的前处理；液相色谱-串联质谱法灵敏度和准确度均较高，所需血清量小，但仪器设备昂贵。上述方法在吸烟筛查的应用中均普及困难。

发明内容

鉴于目前缺乏在微量人血清中高效、准确且低成本的检测尼古丁和可替宁的方法，本发明提供一种基于气相色谱-串联质谱快速测定微量人血清中尼古丁和可替宁的方法，本发明方法前处理非常简单，且检测快速、准确，省时、高效且成本低，非常适用于大样本人群的吸烟及其危害评估的研究，也可用于控烟成效的客观评价与分析。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于气相色谱-串联质谱快速测定微量人血清中尼古丁和可替宁的方法，包括：取15～100μL人血清，加入5～50μL氘代同位素内标溶液混匀，再加入45～300μL甲醇，充分涡旋，离心，取上清液进行气相色谱-串联质谱检测；根据定性离子对和保留时间对尼古丁、可替宁进行定性；将尼古丁或可替宁的定量子离子的峰面积与氘代同位素内标的定量子离子的峰面积的比值分别代入尼古丁或可替宁的基质匹配内标标准曲线，获得尼古丁和可替宁的浓度；

其中，气相色谱检测条件：色谱柱为DB-EUPAH毛细管柱，规格为：柱长15～30m，内径0.18～0.25mm，膜厚0.14～0.25μm；进样量为1～2μL，进样方式为不分流进样，进样口温度为200～280℃；色谱柱初始温度为35～100℃，保持1min，以20℃/min升至280℃，保持2min；

串联质谱检测条件：电子轰击电离源，70eV；离子源和传输线的温度均为300℃；检测模式为MS/MS检测模式。

优选的，取25μL人血清，加入5μL氘代同位素内标溶液混匀，再加入70μL甲醇，充分涡旋，离心，取上清液进行气相色谱-串联质谱检测。

优选的，所述的氘代同位素内标为氘代苊；所述的氘代同位素内标溶液为氘代苊浓度为1μg/mL的甲醇溶液。

所述的离心条件为：在温度4～40℃下、以转速5000～12000rpm/min离心5～15min；优选为：在温度4℃下、以12000rpm/min离心10min。