[发明专利]HRP标签纳米抗体融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了HRP标签纳米抗体融合蛋白及其制备方法与应用。本发明公开了一种带有Trx标签的HRP与B型肉毒毒素纳米抗体(HRP‑Nb)的重组表达方案，通过构建HRP‑Nb融合表达质粒，实现了HRP‑Nb在大肠杆菌中的可溶性表达，并公开了HRP‑Nb抗体的纯化及活化方案，进一步提高了HRP‑Nb抗体活性。基于此本发明还建立了一种快速、灵敏的用于B型肉毒毒素检测的双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测体系，检测灵敏度可达12.2ng/ml，并且与现有的利用单克隆抗体或多克隆抗体的ELISA检测方法相比，本发明的HRP‑Nb抗体还具有如下优点：成本低、生产方便、并减少了商业二次抗体的使用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及HRP标签纳米抗体融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是一种源于蔬菜植物辣根中的酶，分子量约为44kDa，是由无色的糖蛋白和亚铁血红素结合而成的复合物，与四甲基联苯胺(TMB)作用可反应产生蓝色，强酸可抑制HRP酶活性，在与TMB反应后加入浓硫酸产物会变成黄色，因此该原理被广泛应用于酶联免疫分析技术中。

根据现有文献报道，HRP蛋白多为从辣根植物中提取获得，很难实现重组表达。为了实现免疫检测，HRP需要偶联到抗体分子上。HRP与抗体的偶联结合通常通过化学偶联的方法进行。随着近年来小分子抗体的研发不断成熟，也有HRP与小分子抗体融合表达的案例，但小分子抗体与HRP融合表达只有在哺乳动物细胞中能实现，在大肠杆菌中很难实现可溶性重组表达。其主要原因是HRP分子中有较多的二硫键，在原核表达系统中很难实现正确折叠，即使表达也以包涵体形式存在，对HRP包涵体的复性也具有一定难度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种融合蛋白(将其记作融合蛋白甲)。

本发明提供的融合蛋白甲依次包括Trx标签、辣根过氧化物酶HRP和纳米抗体；

所述Trx标签的氨基酸序列如序列1第1-111位所示；

所述辣根过氧化物酶HRP的氨基酸序列如序列1第127-435位所示。

进一步的，所述融合蛋白甲依次包括Trx标签、连接肽、辣根过氧化物酶HRP、连接肽和纳米抗体。所述连接肽的氨基酸序列具体如序列1第112-126位所示。

再进一步的，所述纳米抗体可为B型肉毒毒素纳米抗体。所述B型肉毒毒素纳米抗体的氨基酸序列具体如序列1第453-569位所示。

更进一步的，所述融合蛋白甲为如下R1)-R3)所示的蛋白质：

R1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

R2)将R1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

R3)与R1)或R2)所示的氨基酸序列具有90％或90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。所述同一性包括与本发明序列1所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供与上述融合蛋白甲相关的生物材料，所述生物材料为编码上述融合蛋白甲的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。编码上述融合蛋白甲的核酸分子具体可为序列2所示的DNA分子。

本发明还有一个目的是提供上述融合蛋白甲的制备方法。

本发明提供的融合蛋白甲的制备方法包括如下步骤：使上述融合蛋白甲的编码基因在生物或生物细胞中进行表达，得到上述融合蛋白甲。

进一步的，所述生物为原核生物。所述原核生物具体可为大肠杆菌。