[发明专利]基于微滴式数字PCR同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的引物探针组及试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的引物探针组及试剂盒。本发明包含两组不同的特异性引物和探针。本发明提供的CSFV/BVDV双重微滴式数字PCR检测试剂盒可以对低拷贝数的CSFV和BVDV进行定量检测，同时灵敏度可以检测达到单个拷贝数的目的核算，填补了CSFV和BVDV无法定量检测的空白。本发明适用于猪瘟和/或牛病毒性腹泻感染诊断，可实现同时对猪瘟和牛病毒性腹泻的鉴别诊断；本发明适用于猪瘟和/或牛病毒性腹泻的定量监测，可实现不依赖标准曲线对起始病毒含量进行定量。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的引物探针组及试剂盒。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。以高热、内脏器官严重出血和高死亡率为特征。猪瘟在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘垂直感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、木乃伊胎等。牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种传染病，可以感染羊、鹿、猪以及多种野生动物，猪感染后不表现典型临床症状，偶见体温升高、出现类似于非典型猪瘟的临床症状和病理变化，通过临床很难与非典型猪瘟进行鉴别诊断，需通过实验室检测才能鉴别诊断。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒均属于黄病毒科瘟病毒属，是RNA病毒，传统的检测方法包括ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温技术、重组酶扩增酶检测技术等，但均存在灵敏度不高、不能绝对定量等缺点。

目前，临床上，尚未有关于CSFV和BVDV混合感染的微滴式数字PCR检测方法或试剂盒的相关报道，无法同时进行定量检测。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于微滴式数字PCR同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的引物探针组，可以对低拷贝数的CSFV和BVDV进行定量检测，同时灵敏度可以达到单个拷贝数，填补了CSFV和BVDV无法定量检测的空白。

本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒在同时定量检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种基于微滴式数字PCR同时检测猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的引物探针组，所述引物探针组序列为：

CSFV-F：5’-GAGATGCTACGTGGACGAGG-3’；

CSFV-R：5’-CTAATAGTGGGCCTCTGCGG-3’；

CSFV-Probe：FAM-TCGCTAGGGTGAAATCACGCCACGTG-TAMRA；；

BVDV-F：GACAAGCCTCGAGATGCCAC；

BVFV-R：ACCGTTTTCACCTGAACGACC；

BVDV-Prboe：VIC-ACGAGGGCATGCCCACAGCACATCT-TAMRA。

本发明还提供了一种含有上述的引物探针组的试剂盒，具体组成为：CSFV-F、CSFV-R、CSFV-Probe、BVDV--F、BVDV-R、BVDV-Probe,2×supermx反应液、模板RNA和DEPC水组成。

进一步的，所述CSFV-F、CSFV-R、CSFV-Probe、BVDV--F、BVDV-R、BVDV-Probe在PCR反应体系内的体积比为：2:2:1:2:2:1。

进一步的，所述试剂盒中还包括阳性标准品质粒；所述阳性标准品质粒为CSFV阳性标准品质粒和/或BVDV阳性标准品质粒。