[发明专利]羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的应用

说明书

本发明涉及一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的应用，该试剂盒包括以下四种试剂：I液、II液、III液、IV液和质控标准品；其中所述I液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～8；所述II液为100mM含有人CES1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；所述III液体为荧光素检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg²⁺及50g/ml的荧光素酶；IV液体为10mg/ml的不同种属的重组表达CES1单酶的pH 6.5的磷酸盐溶液，不同种属是人、狗、猪、猴、兔、大鼠或小鼠；所述质控标准品为10mM的羧酸酯酶广谱抑制剂。与现有技术相比，本发明具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

技术领域

本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的使用方法。

背景技术

哺乳动物羧酸酯酶(CES)，包括CES1、CES2、CES3和CES5，CES6负责催化大量结构多样的内源性和外源性底物的水解和酯交换反应，包括外源性、药物和脂质[ActaPharmaceutica Sinica B,2018.8(5):p.699-712；Protein and Peptide Letters,2009.16(10):p.1207-1214.]。作为最丰富的哺乳动物代谢酶之一，CES1A 因以下原因而受到越来越多的关注。首先，CES1A有助于水解许多含酯或酰胺的内源性底物，如胆固醇酯和甘油三酯，并在脂质代谢稳态中起关键作用[Annual Review of Pharmacology andToxicology,1998.38:p.257-288]。其次，CES1A还参与药物代谢，包括介导许多前药(埃莫卡普利和奥司他韦)的激活或促进酯化药物 (氯吡格雷)的代谢失活[Molecules,2008.13(2):p.412-431]。此外，最近的研究表明，CES1A作为一种新的血清学生物标记物，可在损伤后从人类肝细胞释放到细胞外[ACS sensors,2020.5(7):p.1987-1995.]。此外，CES1A已被确定为高甘油三酯血症的治疗靶点，因为CES1A负责肝细胞中甘油三酯储存的水解[NatureReviews Drug Discovery,2012.11(1):p.52-68]。

由于上述CES1A的重要药理和生理功能，动物模型是其进一步研究，特别是新药临床前药代动力学和毒理学研究不可缺少的工具。然而，由于人类和模型动物 (如食蟹猴、狗、小型猪、大鼠和小鼠)之间CES1表达功能的差异，选取动物模型需要明确该酶的活性差异[Life Sci,2007.81(11):p.924-32.]。然而，以前的策略，包括qRT PCR、westernblotting和蛋白质组学技术，只能评估CES1的mRNA或蛋白质水平，而不能评估其实际功能[Mol Phylogenet Evol,2010.57(1):p.23-34.]。这大大限制了对CES1在细胞过程和人类疾病中潜在作用的探索，以及CES1调控剂作为候选药物的发展。亟待能快速检测不同动物模型中出现使得评估CES1功能的种间差异成为可能。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种羧酸酯酶1 抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的使用方法。该检测方法使用4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯，探针经 CES1水解后可生成萤火虫荧光素酶的底物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1.一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒，该试剂盒包括以下四种试剂：I液、II液、III液、IV液和质控标准品；

其中所述I液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～8；

所述II液为100mM含有人CES1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；