[发明专利]噬菌体展示介导的免疫多重定量PCR方法及其重组噬菌体

说明书

本发明提供噬菌体展示介导的免疫多重定量PCR方法，所述方法包括以下步骤：将捕获抗体包被于孔板的孔底，将包被抗体的孔板加入封闭液封闭，加入重组噬菌体，使得重组噬菌体与所述捕获抗体充分结合，在所述重组噬菌体与所述捕获抗体充分结合后，裂解结合后的所述重组噬菌体，收集洗脱液，作为多重定量PCR反应模板，和进行实时荧光多重定量PCR反应。本发明方法将抗原抗体反应可以转化为DNA检测，并显着提高检测的通量。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及噬菌体展示介导的免疫多重定量PCR 方法及其重组噬菌体。

背景技术

自出现2019冠状病毒病(COVID-19)以来，持续的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)大流行已引发全球公共卫生危机。由于其在病毒嗜性和传染性方面的重要性，S蛋白已成为大多数疫苗和抗体药物的靶标。然而，作为具有高突变率的单链正链RNA病毒，在SARS-CoV-2大流行期间积累了突变，并产生了具有更高适应性和可能逃避免疫反应的变体。

在疫苗接种率不断提高和变异体出现的背景下，评估人群中针对不同变异体的体液免疫状态并调整对策将在对抗病毒传播方面发挥重要作用。自COVID-19 大流行开始以来，已经开发了许多基于SARS-CoV-2的刺突、核衣壳和其他蛋白质的血清学检测方法。这些测定采用不同的技术，例如ELISA、侧向流动免疫测定(LFIA)和化学发光酶免疫测定(CLIA)。然而，这些技术中的大多数仅可以对靶向某种蛋白质的抗体水平进行单重检测。基于荧光免疫分析，Luminex可以同时分析针对多种不同SARS-CoV-2抗原的抗体，例如S1、RBD和核衣壳蛋白。2021年，Niklas等人。将野生型(WT)或突变型S蛋白转染到Ramos 人B淋巴瘤细胞系中，并构建了基于颜色的条形码标记流式细胞术(BSFA)，它可以比较针对野生型SARS-S蛋白及其变体的抗体水平。然而，用于荧光免疫测定的多重微珠和稳定转染的细胞系需要严格的生产和储存条件，而基于流式细胞仪的测定仍将受到通量的限制。

噬菌体免疫沉淀测序(PhIP-Seq)于2011年首次报道，噬菌体展示的抗原文库由合成寡核苷酸编码。在对血清样本进行免疫沉淀后，深度DNA测序可以对每种肽的抗体依赖性富集进行量化。通过这种方式，体液免疫测定可用于 DNA测序，显着提高测定的通量。然而，由于合成寡核苷酸文库的长度有限，这种噬菌体展示方法只能检测线性表位定向抗体。2021年，Stoddard等人在噬菌体展示的抗原库中捕获了跨越SARS-CoV-2整个蛋白质组的免疫原性肽。通过对19名COVID-19患者的体液免疫测定，S、N和ORF1ab被确定为高免疫原性区域。然而，由于展示片段不足以形成有效构象，该研究未能检测到靶向 RBD区域的抗体反应。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种噬菌体展示介导的免疫多重定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：将捕获抗体包被于孔板的孔底；步骤2：将包被抗体的孔板加入封闭液封闭；步骤3：加入重组噬菌体，使得重组噬菌体与所述捕获抗体充分结合；所述重组噬菌体基因组中同时插入了抗原序列和用于探针识别的序列，所述探针识别的序列用于同时检测不同的重组噬菌体，所述抗原序列用于与所述捕获抗体反应，所述抗原序列是至少二种以上；步骤4：在所述重组噬菌体与所述捕获抗体充分结合后，裂解结合后的所述重组噬菌体，收集洗脱液，作为多重定量PCR反应模板；和步骤5：进行实时荧光多重定量PCR反应。

在一种实施方式中，将所述抗原序列插入至所述噬菌体的pⅢ蛋白信号肽与结构区之间。

在一种实施方式中，将所述探针识别的序列插入至所述噬菌体的结构区之后。

在一种实施方式中，将SARS-CoV-2 RBD序列插入至M13KO7噬菌体的pⅢ蛋白信号肽与结构区之间，所述SARS-CoV-2 RBD序列包括野生型和突变型序列。

在一种实施方式中，步骤2中，以PBST配制2％BSA作为封闭液。