[发明专利]一种提高软骨素-4-O-磺基转移酶-1表达效率及酶活的方法

说明书

本发明公开了一种提高软骨素‑4‑O‑磺基转移酶‑1表达效率及酶活的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过将分子伴侣与软骨素‑4‑O‑磺基转移酶‑1共表达，提高了酶的可溶性表达，可使人源磺基转移酶C4ST‑1的酶活提高至103.4U/L，在20mg/mL底物的情况下，硫酸化程度达到了72％。本发明还通过优化发酵条件，使得共表达分子伴侣TF的重组大肠杆菌软骨素‑4‑O‑磺基转移酶‑1的酶活提高到了128.5U/L，硫酸化效率达到了78.5％，实现了磺基转移酶酶活的大幅度提高，并且不影响酶的结构与后续纯化，为酶法生产硫酸软骨素提供了有效方法。

技术领域

本发明涉及一种提高软骨素-4-O-磺基转移酶-1表达效率及酶活的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1(Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1，C4ST-1；又名Carbohydrate sulfotransferase 11，CHST11)，能够将来自3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸盐(PAPS)的硫酸基团添加到不断增长的多糖链中，催化与GlcA相连的GalNAc的4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(CSA)。C4ST-1在真核和原核宿主中的表达均有报道，最初是在哺乳动物细胞COS和CHO细胞中得以成功表达，康振等在毕赤酵母中实现了人源C4ST-1的表达并具有一定酶活力，随后在毕赤酵母中实现了以甲醇为碳源全生物法合成硫酸软骨素；另外，Mattheos A.G.Koffas团队通过构建代谢路径在大肠杆菌K4菌株中首次实现了以原核细胞生产硫酸软骨素。以上都证明了异源表达人源C4ST-1的可行性。

然而，人源C4ST-1在微生物中的异源表达仍然存在诸多问题，在真核微生物中，如酵母中表达酶活力较低，而在原核生物中由于缺乏翻译后修饰，表达量过低。何文琴等设计了一个C4ST-1构建体，以其糖基化和非糖基化形式在大肠杆菌和毕赤酵母中表达，大肠杆菌表达的C4ST-1主要以不溶形式存在于包涵体中而毕赤酵母中的C4ST-1具有更高的总转化率和优异的活性，但在存储时不稳定。而在原核中表达时，仍然采用促融标签、优化培养基组分、优化诱导条件(诱导剂浓度、诱导温度)等，但是效果有限，只能实现低浓度的可溶性表达。因此，需要开发新的提高C4ST-1可溶性表达的方法。

发明内容

本发明提供了一种有效简单、干扰性小且无需真核系统来实现人源磺基转移酶C4ST-1高效表达及酶活力提高的方法，技术方案如下:

本发明提供了一种产人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1的重组大肠杆菌，是将人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1与分子伴侣通过质粒共表达。

在一种实施方式中，所述人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，编码所述分子伴侣的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～8任一所示。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pET系列质粒、pRSFDuet系列质粒。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为E.coli Rosetta(DE3)。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET32a(+)表达所述人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1，并以pRSFDuet-1表达所述分子伴侣。

本发明还提供了应用所述重组大肠杆菌发酵生产人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1的方法。

在一种实施方式中，所述发酵是在TB培养基中发酵。

在一种实施方式中，利用IPTG诱导所述重组大肠杆菌产人源软骨素-4-O-磺基转移酶-1。

在一种实施方式中，所述诱导是将所述重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀≥0.6。