[发明专利]一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法

说明书

本发明公开了一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法。本方法利用TetO控制的慢病毒系统，建立了一种利用转录因子组合将小鼠体细胞重编程成自主神经节类器官(induced autonomic ganglion，iAG)的方法；实验结果表明Ascl1、Phox2a/2b和Hand2三种转录因子组合能够将小鼠胚胎成纤维细胞诱导生成自组织的、网络连接的神经团。本方法表明Ascl1、Phox2a/2b和Hand2三因子是将小鼠成纤维细胞重编程iAG类器官的有效手段，诱导产生的iAG类器官可能作为一个模型来破译自主神经性疾病的发病机制，筛选有效的药物和细胞替代治疗的来源。

技术领域

本发明属于细胞重编程、细胞替代治疗生物技术领域，具体涉及一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法。

背景技术

神经节是存在于外周神经系统(peripheral nervous system，PNS)或中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的一簇或一群神经细胞。它们经常相互连接，并与PNS和CNS其他结构连接，形成复杂的神经网络。自主神经系统(autonomic nervous system，ANS)控制由平滑肌纤维、心肌纤维和腺体活动调节的非自主功能，如循环、呼吸、心率、体温、出汗、消化和新陈代谢，不能被意识控制，被认为是一种“自动”的神经系统(Cannon,1963；Goldstein,2013)。ANS由交感神经、副交感神经和肠神经系统组成，其中包含多种不同神经元亚型，支配不同的组织和器官。它们是由下丘脑输入到脑干和脊髓的节前神经元来控制的，这些神经元又决定了自主神经节中初级内脏运动神经元的活动。自主神经节由不同类型的功能神经元组成(如调控血管收缩、分泌运动、毛发运动)，支配每个靶组织的神经元亚群可以表达不同神经递质、神经肽、离子通道和受体，它们共同构成了神经元的化学表型(Cane and Anderson,2009)。

外周自主神经节细胞的特异性和分化依赖于细胞外在因素和细胞内在因素的相互作用。其发育过程中的内在因素主要是由转录因子形成的调节网络控制，研究表明，Ascl1/Mash1(Achaete-scute homolog 1)控制着不同神经系中神经元祖细胞发育，突变Ascl1小鼠出生夭折，嗅觉上皮、交感神经、副交感神经和肠神经严重受损(Guillemot etal.,1993；Pattyn et al.,2006)。在外源性BMP2缺失的情况下，Mash1可诱导Phox2a(Paired-like homeobox 2a)和c-RET的表达并促进神经元分化和泛神经元基因的表达。在体内，自主神经节中Phox2a的表达在Mash1^-/-胚胎中显著降低(Lo et al.,1998)。在培养的神经嵴过表达Phox2a引起交感肾上腺素能细胞数量强烈增加。而鸡胚中Phox2a的表达促进去甲肾上腺素能标记基因DBH(dopamine beta-hydroxylase)和TH(tyrosinehydroxylase)、泛神经元基因SCG10和NF160以及胆碱能基因ChAT(cholineacetyltransferase)和VAChT(vesicular acetylcholine transporter)的表达(Stankeet al.,1999)。Phox2b的敲除结果确定了Phox2b是自主神经元发育的重要基因(Pattyn etal.,1999)。研究表明，Phox2足以促进交感神经元的产生，并直接或间接地控制大量交感神经元特有基因的表达。事实上。Ascl1和Phox2对交感神经元的发育都是必不可少的(Lo etal.,1998；Stanke et al.,2004)。此外，Hand2(heart and neural crest derivativesexpressed 2)对去甲肾上腺素能交感神经元分化具有必要和选择性。神经嵴特异性敲除Hand2导致进行性神经元损失、酪氨酸羟化酶TH和多巴胺羟化酶DBH显著减少，导致初始去甲肾上腺素能分化受阻(Hendershot et al.,2008；Lucas et al.,2006；Morikawa etal.,2007)。