[发明专利]一种用于检测凝血酶活性及凝血酶抑制剂活性的荧光传感器及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种用于检测凝血酶活性及凝血酶抑制剂活性的荧光传感器及其制备方法与应用，所述荧光传感器包括由聚集诱导发光探针与凝血酶发色底物交联得到的纳米颗粒。本发明提供的荧光传感器制备简单、反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备，既可用于检测凝血酶活性又可用于凝血酶抑制剂活性的检测，进而也可用于药物中抗凝血组分的筛选，相较于现有技术的检测或筛选方法而言具有成本低、简单、快速、高效的优势。

技术领域

本发明属于生物传感领域，涉及一种用于检测凝血酶活性及凝血酶抑制剂活性的荧光传感器及其制备方法与应用。

背景技术

COVID-19是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的病毒感染。研究报告显示，几乎所有重症COVID-19患者伤口均出现凝血功能障碍并伴有血栓并发症，静脉血栓栓塞事件的发生率高达30％。凝血病发生在COVID-19患者和弥散性血管内凝血(DIC)和血栓性微血管病(TMA)。DIC的发病标志之一是凝血酶生成失调，这通常是由促炎细胞因子诱导的单核细胞和可能的内皮细胞上的组织因子表达的结果，最突出的是白细胞介素(IL)-6。

凝血酶，也称为人α-凝血酶(因子IIa)，是一种球状胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其大小约为36千道尔顿(KD)，存在于常见的凝血途径中。凝血酶是止血和血栓形成的关键蛋白。凝血酶是由其前体凝血酶原在凝血酶原复合物Xa因子的作用下酶促产生的，该复合物还包括磷脂、钙和Va因子。在生理上，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，最终导致血栓形成。凝血酶还激活因子XIII，然后交联纤维蛋白以加强形成的凝块。病理学上，凝血酶在血管损伤和各种病理活动中起重要作用，如血栓性疾病、动脉粥样硬化和肿瘤等。同时，凝血酶可作为调节炎症、动脉粥样硬化和血栓形成的主要靶点。例如凝血酶可以激活PAR-4并在大鼠肠系膜静脉中引起炎症反应。PAR-4受体缺乏可激活血小板，减少微血管炎症和脑缺血再灌注损伤。凝血酶还可以通过调节Rho激酶抑制剂的功效来改善动脉粥样硬化并发症。Gremmel等人发现血小板因子4、凝血酶原1和可溶性簇分化40配体是晚期动脉粥样硬化的标志物，与凝血酶呈正相关。

目前，现有技术一般采用电化学方法或ELISA试剂盒来对凝血酶活性进行检测，操作繁琐而且试剂盒非常昂贵，因此如何开发一种成本低、简单、快速、高效的凝血酶活性检测方法成为本领域技术人员亟待解决的问题。

血必净(XBJ)是一种中药注射液，内含当归、赤芍、川芎、红花、丹参5种中药成分，具有活血化瘀、通经通络的作用，已被证明可有效治疗COVID-19病例。XBJ具有拮抗氧化应激、抑制炎症反应、调节免疫反应、改善凝血功能等现代药理作用。Satoshi Gando等人发现控制凝血酶、纤溶酶和炎症是改善COVID-19凝血功能障碍的关键。然而，血必净中究竟是哪种或哪些成分具有抗凝血活性，来实现改善COVID-19凝血功能障碍的还未可知。

由于中药成分复杂，可能包括上百种成分，因此在确定中药疗效的同时，本领域技术人员往往需要对中药中的活性成分进行分析，来筛选出该中药中发挥特定作用的具体成分。以抗凝血活性为例，目前现有技术一般首先通过柱层析、旋蒸等过程分离得到中药中的不同组分，然后采用试剂盒法来筛选具有抗凝血活性的组分，一般通过检测500nm左右的紫外吸收强度来反应组分的抗凝血活性。然而，一方面，柱层析等步骤操作复杂、耗时，而且对样本量要求高(一般需要5毫克样本才能实现活性检测)，另一方面，中药中的一些成分是有紫外吸收的，所以会造成干扰，导致检测结果不准确。

因此，如何提供一种简单、快速、灵敏度高的中药抗凝血组分筛选方法成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测凝血酶活性及凝血酶抑制剂活性的荧光传感器及其制备方法与应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：