[发明专利]一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为序列1所示，包括：PCV3多肽表位、三聚体结构域和连接PCV3多肽表位与三聚体结构域的序列：GTAGGGSG；所述三聚体结构域为鸡软骨基质蛋白，其氨基酸序列如序列8所示；

PCV3多肽表位包括四条抗原表位的多肽：Epitope1、Epitope2、Epitope3、Epitope4，其氨基酸序列分别如：序列3、序列4、序列5、序列6所示；

和通用型T细胞抗原表位的多肽Epitope5，其氨基酸序列如序列7所示，用于激活CD4+细胞；

Epitope1、Epitope2、Epitope3、Epitope4、Epitope5之间通过氨基酸序列GGGGSGGGGS连接。

2.表达如权利要求1所述的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白的核苷酸序列，其特征在于，如序列2所示。

3.如权利要求1所述的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.以序列2所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，得到PCV3-Trimer基因片段；

步骤2.将PCV3-Trimer基因片段和经过酶切线性化的pET28a载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单菌落培养，进行菌落PCR鉴定，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pET28a-PCV3-Trimer；

步骤3.将重组表达质粒pET28a-PCV3-Trimer转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得重组表达菌株pET28a-PCV3-Trimer，将表达菌株接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃在摇床上培养，获得种子液；

步骤4.将种子液以3％的比例接种于发酵罐进行培养，至OD₆₀₀值为20时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，在pH 7.0、溶氧不低于30％、25℃条件下，发酵培养8～10h；

步骤5.发酵液离心收集菌体，并加入裂解液重悬菌体，高压匀浆破碎，离心收集破碎上清液，采用Ni-NTA亲和层析去除杂蛋白及内毒素，得到纯化的所述重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5中破碎上清液除去杂蛋白及内毒素的步骤包括：将所述上清通过0.45μm中空纤维柱澄清降低浊度后层析上样，通过含0.1％ Triton X114的咪唑洗涤液洗涤层析柱，洗去杂蛋白及内毒素；通过裂解缓冲液洗涤层析柱，洗去残留的Triton X114；再通过咪唑洗脱液洗脱所述重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白，收集洗脱液进行脱盐、过滤除菌。

5.如权利要求1所述的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白在PCV3亚单位疫苗中的应用。