[发明专利]一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明公布了一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用，本发明利用生物信息学方法和资源预测了PCV3Cap蛋白B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，考虑到抗原表位的稳定性和免疫原性，设计了一种基于PCV3Cap蛋白抗原表位的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白，并实现了其在大肠杆菌中高效可溶性表达，表达的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白可通过Ni‑NTA亲和层析大规模生产纯化，纯化的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白能组装成稳定的三聚体结构，利用该重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白制成的亚单位疫苗能诱导实验猪产生较高水平的抗体，对实验猪有显著的保护作用，本发明设计的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白为PCV3疫苗的研制提供了一种新的思路。

技术领域

本发明属于基因工程疫苗领域，具体涉及重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科的圆环病毒属，被认为是全球最具经济灾难性的病毒病原体之一。PCV1被认为对猪无致病性，而PCV2是仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原；2016年PCV3在美国首次报道，此后已在多个国家的农场检测到PCV3，包括波兰、韩国、意大利、巴西和中国。据报道，PCV3与猪皮炎和肾病综合征、先天性震颤、生殖障碍和多系统炎症有关。虽然已发现PCV3与PCV2具有相似的综合征，但是PCV3的衣壳蛋白序列与PCV2同源性较低，PCV2疫苗对PCV3感染的没有起到交叉保护作用，PCV3的抗血清也没有与PCV1和PCV2样本发生交叉反应。因此，需要进一步从分子和结构层面研究PCV3的发病机制，为PCV3诊断试剂盒和疫苗的设计和开发提供有益的思路。

猪圆环病毒3型是一种无囊膜的单股环状DNA病毒，是最小的DNA病毒之一，其基因组包含两个主要开放阅读框(ORF)。ORF1编码复制相关蛋白，ORF2编码衣壳蛋白。PCV3 Cap蛋白能够以T＝1的二十面体对称性自组装成类似于PCV2病毒样颗粒(VLP)，PCV3 VLP的组装可以为设计和开发有效的PCV3疫苗提供线索。研究人员相继将PCV3 Cap蛋白在大肠杆菌、酵母和昆虫表达系统中表达，但是这些系统表达的PCV3 Cap蛋白要么形成了无活性的包涵体，要么蛋白的表达量极低只能通过Western Blot检测到，获得一定产量较纯的PCV3Cap需要复杂的纯化工艺，高昂的成本使其难以用于动物疫苗的大规模生产及应用推广。由于PCV3毒株难以分离培养且各种表达系统表达的PCV3 Cap蛋白难以大规模生产，截至目前还没有可用的PCV3疫苗。

发明内容

由于目前PCV3毒株难以分离培养制备成灭活疫苗，且各种表达系统表达的PCV3Cap蛋白产量低，稳定性差，生产成本高，难以大规模生产制备成亚单位疫苗。为解决目前缺乏PCV3疫苗的问题，本发明利用生物信息学方法和资源预测了PCV3 Cap蛋白B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，考虑到抗原表位的稳定性和免疫原性，设计了一种基于PCV3 Cap蛋白抗原表位的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白，并实现了其在大肠杆菌中高效可溶性表达，表达的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白可通过Ni-NTA亲和层析大规模生产纯化，纯化的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白能组装成稳定的三聚体结构，利用该重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白制成的亚单位疫苗能诱导实验猪产生较高的抗体水平，对实验猪有显著的保护作用，本发明设计的重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白为PCV3疫苗的研制提供了一种新的思路。

本发明目的之一提供一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白，其氨基酸序列为序列1所示，包括：PCV3多肽表位、三聚体结构域和连接PCV3多肽表位与三聚体结构域的序列：GTAGGGSG；所述三聚体结构域为鸡的软骨基质蛋白，其氨基酸序列如序列8所示；

PCV3多肽表位包括四条抗原表位的多肽：Epitope1、Epitope2、Epitope3、Epitope4，其氨基酸序列分别如：序列3、序列4、序列5、序列6所示；

和通用型T细胞抗原表位的多肽Epitope5，其氨基酸序列如序列7所示，用于激活CD4+细胞；