[发明专利]一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法

权利要求书

1.一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含编码BaEV糖蛋白序列的慢病毒包装质粒；

2)构建含CAR结构序列的慢病毒表达质粒；

3)将步骤1)中所述含BaEV糖蛋白的慢病毒包装质粒、步骤2)中含CAR结构序列的慢病毒表达质粒和pCMV-dR8.9质粒在转染试剂作用下转染细胞，经培养收集表达BaEV糖蛋白和CAR的慢病毒；

4)将步骤3)中所述表达BaeV糖蛋白和CAR的慢病毒转导NK细胞，得到表达CAR的NK细胞；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述NK细胞包括原代NK细胞和NK92细胞株。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述原代NK细胞包括记忆样NK细胞。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述记忆样NK细胞的诱导方法，包括将原代NK细胞在含细胞因子的NK扩增培养基中进行刺激；所述细胞因子包括10ng/ml rhIL-12、50ng/ml rhIL-15和50ng/ml rhIL-18。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)中所述转导的方法为用MOI＝10的病毒滴度转导10⁶个NK细胞。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述构建含编码BaEV糖蛋白序列的慢病毒包装质粒的方法，将密码子优化的编码BaEV糖蛋白序列通过同源重组技术插入pCMV质粒中，所述密码子优化的编码BaEV糖蛋白序列如核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中所述构建含CAR结构序列的慢病毒表达质粒的方法，将CAR结构序列插入pHIV-EGFP质粒的XbaI/ClaI位点处。

8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，所述CAR结构序列依次包括anti-CD-19scFv，CD8α铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞浆区；

所述CAR结构序列如核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中所述含BaEV糖蛋白的慢病毒包装质粒、含CAR结构序列的慢病毒表达质粒和pCMV-dR8.9质粒的质量比为3:10:5。

10.权利要求1～9任意一项所述方法制备的表达CAR的NK细胞在制备杀伤肿瘤药物中的应用。