[发明专利]一种纤连蛋白和胶原蛋白的融合蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种纤连蛋白和胶原蛋白的融合蛋白及其制备方法，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，融合后的胶原蛋白在不影响纤连蛋白功效的前提下，能够有效的降低纤连蛋白细胞毒性，提高原料生物安全性；与原单一序列相较，能够有效提高纤连蛋白细胞增殖率；与胶原蛋白的融合也使得纤连蛋白表达量明显增高，能够使得表达量达到2g/L，远高于原单一序列表达量；与此同时，纤连蛋白在‑20℃，4℃，40℃稳定程度远高于原单一序列稳定性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种纤连蛋白和胶原蛋白的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

纤连蛋白(fibronectin，Fn)是一种分子量约为440kDa的大糖蛋白，由2个分子质量为220kDa的亚基通过二硫键连接而成的二聚体，其分子形状是由两条相似的A链及B链组成，呈V形。Fn的亚基有6个致密的球状体，每一区均有特定的功能，可与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。Fn在生命活动中广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子作用。

研究Fn在创伤修复中的作用时发现，在创伤初期的凝血阶段，Fn从血小板中释放出来，沉积在受损胶原和纤维蛋白上，会增强血小板附着、吞噬细胞和成纤维细胞迁移以及细胞增殖，Fn激活中性粒细胞，增强其黏附力，加速其向创伤区聚集。在创伤修复中期，Fn是成纤维细胞的重要趋化因子，可通过帮助维持细胞骨架结构来增强细胞的粘附和趋化。

当Fn与纤维蛋白交联后黏附于血凝块上，有助于成纤维细胞在其上的移动，并迅速进入创伤区。进入创伤区的成纤维细胞可大量分泌Fn，并与Ⅲ型胶原共同沉积在细胞间质中，当成纤维细胞纺出一张纤维蛋白原纤维网时，实际的愈合过程就开始了。纤连蛋白还通过刺激内皮细胞迁移增强新生血管的形成。

胶原蛋白作为一种纤维蛋白，其基本组成单位是原胶原分子。原胶原分子是由三股α-螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，长度约为300nm，直径约1.5nm，分子量为300kDa。胶原中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸残基的1/3，其一级结构(肽链)均为(GLy-X-Y)n重复序列；其次是脯氨酸和羟脯氨酸，含量高达15％至30％，这两种氨基酸为胶原所特有，但色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低。

胶原蛋白能够保护皮肤，提高皮肤的弹性。由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；许多种胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分化、分裂、增殖和迁移有关，能提供皮肤的养分，延缓皮肤衰老，促进皮肤创面修复；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业。

目前，在Fn的制备中，有从血浆原料经处理后得到的冷沉淀富含Fn，最初多采用加温脱纤、甘氨酸脱纤、聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)沉淀、A1(OH)₃吸附、枸橼酸沉淀以及DEAE纤维素离子交换等一系列步骤来制备Fn，但该法操作较复杂，且Fn回收率低；另有尝试用抗Fn亲和层析柱直接吸附血浆Fn、盐酸甘氨酸洗脱的方法来制备Fn，但该法需要专一性抗Fn抗体，成本极高；在后续生产中，开发了以尿素为洗脱液的明胶Sepharose4B亲和层析法来制备Fn，但该法获得的尿素洗脱液中含有较多纤维蛋白原，在纯化过程中纤连蛋白原会变为纤维蛋白析出而堵塞层析柱，从而影响Fn制备。此外，Fn属冷不溶性蛋白，Fn溶液于4℃条件下存放易发生降解，不稳定。

综上，现有的Fn的生产方法较难实现规模化生产，且单一序列的纤连蛋白稳定性较差，限制了其使用条件及作用效果，目前的Fn的产量以及蛋白不稳定的性质难以匹配日益旺盛的市场需求。

发明内容

为克服现有的技术缺陷，本发明目的在于提供一种纤连蛋白和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：