[发明专利]一种高通量特异性捕获miRNA的DNA载体制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高通量特异性捕获miRNA的DNA载体制备方法及其应用。属于液体活检技术领域。包括以下步骤：环状DNA支架链的线性化；设计miRNA特异性检测探针；双链DNA载体的组装。本发明通过在线性M13DNA支架链上设计互补结合的骨架寡核苷酸及两个检测探针，实现高通量特异性捕获目的miRNA，与未经设计的DNA载体相比，有精准捕获、高特异性的优势。利用发明制备的DNA载体可用于捕获及检测癌症相关的外周血和生物组织的miRNAs。

技术领域

本发明涉及液体活检技术领域，更具体的说是涉及一种高通量特异性捕获miRNA的DNA载体制备方法及其应用。

背景技术

随着精准医学及液体活检技术的提出和快速发展，以外周血循环肿瘤DNA、循环miRNA等的一类新型生物标志物开始用于肿瘤的早期诊断和预后监测。目前检测miRNA的方法主要有RNA印迹(Northern blotting)、实时定量PCR(RT-PCR)、基因芯片技术和二代测序等。Northern印迹是研究miRNA表达水平最可靠的技术，它常用于在肿瘤细胞中检测miRNA表达水平，但Northern blotting操作繁琐、样本量需求大、灵敏度较低，不适用于大量临床样本的检测。实时定量PCR(RT-PCR)可快速检测出miRNA，尤其是Pri-miRNA的表达。该方法可以定量分析前体miRNAs和非活化的、成熟的miRNAs，但是对于前体miRNAs和成熟miRNAs之间的表达关系，并不是很清楚。RT-PCR具有较高的灵敏度、重复性和特异性，已成为现阶段核酸分子定量检测的金标准，但该方法使用成本相对较高，步骤相对较多，限制其在miRNA表达谱测定上的广泛应用。miRNA基因芯片技术是一种快速有效的检测miRNA表达图谱的方法，它能同时检测多个miRNA，是目前高通量检测miRNA表达最常用的方法，但芯片方法的前提是分离到高质量的miRNA组分，由于存在背景及混杂信号干扰，重复性较差，主要用于miRNA的初筛，其结果还需采用RT-PCR等方法加以验证。而新一代大规模测序技术主要用于未知序列miRNA的定量检测，虽然有高通量、准确度高的特性，但深度测序价格昂贵，且数据量大，不适用于临床检测，一般用于探寻新的miRNA并对新发现的miRNA进行功能预测。总体来说，随着数字PCR(dPCR)以及新一代测序(NGS)等技术的发展，人们已经可以平行检测多种miRNA，其检测准确度也取得了长足的进步。但是也不免伴随着检测时间长、步骤多，成本昂贵的问题，限制了miRNA作为癌症标志物进行临床大规模使用。近年来，以在单分子水平进行测序为目标的第三代DNA测序技术相继被提出并迅速成功国际研究热点，其中基于纳米孔传感检测技术的第三代DNA测序技术以其无需标记、超长的读长(104～106个碱基)、高通量以及较小的样品需求量等优势被认为是最有望实现快速低成本DNA测序的第三代基因测序技术。其基本原理为当单链DNA分子电泳通过一个位于磷脂双分子层上的纳米孔--通道蛋白α-溶血素时，该通道蛋白的离子电流会被阻塞。由于四种碱基的理化性质不一样，大小结构也不一样，其电流阻塞的幅度也不一样。因此如果可以检测到这四种检测所产生的不同幅度的阻塞电流，就可以推测得出DNA的序列。纳米孔传感检测技术除了在DNA测序领域展示了巨大的吸引力和潜能之外，纳米孔也在单分子传感检测领域发挥着其高精度，非标记的优势。

目前，纳米孔作为一种快速、高通量、高灵敏的单分子传感器已经被广泛应用于单个生物分子，DNA与蛋白相互作用，DNA与探针以及RNA与探针的复合物的检测，在癌症的外周血循环肿瘤DNA、循环miRNA等检测中展示其独有的优势。

目前来说，miRNA的纳米孔捕获有片段小，过孔速度太快，无法一次性识别多个特征序列的问题。如能发展设计一种高通量特异性捕获miRNA的DNA载体，将对癌症相关的特异性miRNA精准捕获、高效检测有重要研究意义。

因此，能否提供一种高通量特异性捕获miRNA的DNA载体制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容