[发明专利]疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂、试剂盒及双重PCR检测方法

权利要求书

1.一种疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂，其特征在于：其包括引物、探针和阳性质控质粒，所述引物包括疟原虫上游引物、疟原虫下游引物、猴D型逆转录病毒上游引物和猴D型逆转录病毒下游引物，疟原虫上游引物、疟原虫下游引物、猴D型逆转录病毒上游引物和猴D型逆转录病毒下游引物的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4；所述探针包括疟原虫探针、猴D型逆转录病毒探针a、猴D型逆转录病毒探针b，疟原虫探针、猴D型逆转录病毒探针a、猴D型逆转录病毒探针b的序列分别为SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7，疟原虫扩增片段长度为199 bp，猴D型逆转录病毒扩增片段长度为122 bp，所述阳性质控质粒的序列为SEQ ID NO:8。

2.一种包含有权利要求1所述的疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂的试剂盒。

3.一种疟原虫和猴D型逆转录病毒的双重PCR检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：

S1、从全血样本中提取脱氧核糖核酸（DNA）；

S2、配制双重荧光定量PCR反应体系，反应体系包括Premix Taq酶、疟原虫上游引物、疟原虫下游引物、猴D型逆转录病毒上游引物、猴D型逆转录病毒下游引物、疟原虫探针、猴D型逆转录病毒探针a、猴D型逆转录病毒探针b、PCR专用水和DNA；

S3、荧光定量PCR反应的反应程序为：在PCR仪中95℃预变性30 s，然后95℃变性5s，60℃退火延伸31s ，在退火延伸时采集信号，并按上述过程进行N次循环；

S4、在整个体系扩增结束后，读取循环数Ct值以及扩增曲线，根据循环数Ct值和扩增曲线来进行检测结果的判断。

4.根据权利要求3所述的疟原虫和猴D型逆转录病毒的双重PCR检测方法，其特征在于：步骤S3的双重荧光定量PCR反应中，在疟原虫和猴D型逆转录病毒基因保守区域设计特异的实时荧光定量PCR引物和探针序列，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，检测不到荧光；在PCR扩增时，Premix Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告荧光基团释放并发出荧光，荧光能被检测仪器接收，通过荧光信号的强弱对PCR产物进行检测。

5.根据权利要求3所述的检测非人灵长类实验动物全血中疟原虫和猴D型逆转录病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于：步骤S2中PCR扩增采用的阳性质控质粒的制备方法是：以pUC57为载体插入疟原虫和猴D型逆转录病毒特异性保守序列合成的质粒穿刺菌转染到大肠杆菌DH5α中，摇菌增殖后采用质粒提取试剂盒提取纯化质粒，用分光光度计测定浓度,并用无菌TE缓冲液将阳性质控质粒浓度稀释至7.3×10⁹拷贝/μL。

6.根据权利要求3所述的检测非人灵长类实验动物全血中疟原虫和猴D型逆转录病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于：步骤S1中，根据样本的类型，采用全血基因组提取试剂盒提取样本的DNA。

7.根据权利要求3所述的检测非人灵长类实验动物全血中疟原虫和猴D型逆转录病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于：

步骤S4中，猴D型逆转录病毒是否阳性的判断方法为：当FAM通道有扩增曲线，且Ct值≤35，判断猴D型逆转录病毒阳性；当无扩增曲线，且Ct值显示Undet或N/A时，或者有扩增曲线，Ct＞38值时，判断猴D型逆转录病毒阴性；当有扩增曲线，35Ct值≤38，建议重复一次实验，复孔检测，若结果相同，则判定35Ct值≤38为猴D型逆转录病毒阳性，35Ct值≤38为猴D型逆转录病毒阳性可疑，建议持续关注该动物，过一段时间后重新采样检测；若无扩增曲线，则判定为猴D型逆转录病毒阴性。

步骤S4中，疟原虫病毒是否阳性的判断方法为：当ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤35，判断猴D型逆转录病毒阳性；当无扩增曲线，且Ct值显示Undet或N/A时，或者有扩增曲线，Ct＞38值时，判断猴D型逆转录病毒阴性；当有扩增曲线，35Ct值≤38，建议重复一次实验，复孔检测，若结果相同，则判定35Ct值≤38为猴D型逆转录病毒阳性，35Ct值≤38为猴D型逆转录病毒阳性可疑，建议持续关注该动物，过一段时间后重新采样检测；若无扩增曲线，则判定为猴D型逆转录病毒阴性。