[发明专利]疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂、试剂盒及双重PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂、试剂盒及双重PCR检测方法，检测试剂包括引物、探针和阳性质控质粒，所述引物包括疟原虫上游引物、疟原虫下游引物、猴D型逆转录病毒上游引物和猴D型逆转录病毒下游引物，所述探针包括疟原虫探针、猴D型逆转录病毒探针a、猴D型逆转录病毒探针b，疟原虫扩增片段长度为199 bp，猴D型逆转录病毒扩增片段长度为122 bp。本发明能特异性识别疟原虫及猴D型逆转录病毒，本发明还揭示了采用该引物、探针的双重实时荧光定量PCR试剂盒，敏感性高、特异性强、重复性好，能够为非人灵长类实验动物临床诊断和疫情监控提供有力的支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种检测非人灵长类实验动物全血中疟原虫和猴D型逆转录病毒的检测试剂、试剂盒及双重PCR检测方法。

背景技术

医学实验动物主要用来预测新药的药理、药效、药代动力学及毒理，各类动物实验在新药研发的不同阶段起着不同的作用。在所有的实验动物中，实验猴作为与人类亲缘关系最为接近的物种，属于实验动物中的高端产品，实验猴产业已成为国际生物医药科技产业链条上的重要一环。实验猴的卫生检疫是实验猴质量安全把关的重要措施。

疟疾是严重危害人类健康的人畜共患疾病。疟疾是由疟原虫（PLAS）感染引起的寄生虫病，疟原虫除了可以感染人类外，还可能感染猴，因而，在实验猴检疫时要进行疟原虫检疫。

猴D型反转录病毒(Simian Retro Virus type D，SRV)属反转录病毒科、D型反转录病毒属，与猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)同为猴获得性免疫缺陷综合征(SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有8个亚型。生物医药研究中应用广泛的亚洲猕猴是SRV病毒的自然宿主,根据亚型的不同和宿主种属的差异,动物感染SRV的临床表现多样,有的动物可能无任何症状,有些动物感染后会产生致死性的猴获得性免疫缺陷综合症,对养殖或实验单位都会造成巨大的经济损失。国内近期爆发流行的主要是SRV-4,SRV-5和新发现的SRV-8,给实验猴养殖和使用单位造成了严重的负面影响。《实验动物:猴逆转D型病毒检测方法(GB/T 14926.61-2001)》规定了猴逆转D型病毒的检测方法。猴逆转D型病毒主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变和免疫机能紊乱，从而干扰实验研究，是普通级猴和SPF猴的必检项目。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同一个反应体系里同时扩增多个靶标，经济简便性多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息，最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒检测领域。专利号：CN 106755567《猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法》公布了猴SRV病毒的引物和探针，但是仅能检测SRV-2、SRV-4以及SRV8病毒,但不能检国内主要爆发流行的毒株SRV-1, SRV-3,SRV-5以及SRV-8；专利号：CN 105624332《猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量 PCR检测方法》公布了同时检猴SRV-1、STLV1以及SIV病毒三重荧光定量PCR的引物和探针，但不能检SRV-2、SRV-3 SRV-4,SRV-5以及SRV-8。

从一般PCR到多重PCR，其实验设计的难度也随之翻倍。如果说扩增一个片段需要三条引物，那么两个片段就需要六条，三个片段需要九条，以此类推。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景，上述困难都是进行多重PCR的绊脚石。