[发明专利]一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的α‑葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明在嗜热厌氧乙醇菌来源α‑葡萄糖苷酶的基础上，通过不同的异肽键来使蛋白环化，获得了三株热稳定性提高的突变菌株SpyTag‑AGL‑SpyCatcher、SnoopTag‑AGL‑SnoopCatcher和SdyTag‑AGL‑SdyCatcher，突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性发生明显的降低。本发明中的这些环化突变体比天然α‑葡萄糖苷酶更适用于工业生产且构建方式简单，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC.3.2.l.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶或α-葡萄糖基转移酶，广泛存在于许多植物、动物、微生物中。根据其底物特异性和蛋白质一级结构，将该酶分成α-葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ两个家族，也就是糖苷水解酶(GH)家族13和31，还可将该酶分成α-葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，这三种类型。例如，α－葡萄糖苷酶家族Ⅰ中的成员，能够水解不同质底物如对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷和蔗糖，且属于α-葡萄糖苷酶Ⅰ型，而α-葡萄糖苷酶家族Ⅱ中的成员则较易水解同质底物如可溶性淀粉、糖原和麦芽低聚糖等，且属于α-葡萄糖苷酶Ⅲ型。大多数α-葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖并发生转苷作用。例如，黑曲霉α-葡萄糖苷酶能从麦芽糖等分子中的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，并能将游离出的葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖等分子中的α-1，6位，形成异麦芽糖、潘糖等低聚异麦芽糖。低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)能使人体内的双歧杆菌得到显著增殖，促进食物的消化吸收，调整肠道内的菌群，增加有益菌的比例，维持肠道正常功能等。将具有潜在价值的α-葡萄糖苷酶基因转入到其它适于工业化生产的工程菌中，实现低成本、高效率表达，用于转苷生产低聚异麦芽糖，具有重要的理论和应用价值。

目前，工业上应用的α-葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α-葡萄糖苷酶在规模化生产IMOs上的应用。

发明内容

为了解决目前α-葡萄糖苷酶热稳定性不高的问题，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶的环化突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上不同的异肽键得到的；所述异肽键包括(a)～(c)任一组：

(a)N端：AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO.3所示)；C端：VDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQ VKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI(SEQ ID NO.4所示)；

(b)N端：KLGDIEFIKVNK(SEQ ID NO.5所示)；C端：

KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPA GYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK(SEQ ID NO.6所示)；

(c)N端：DPIVMIDNDKPIT(SEQ ID NO.7所示)；C端：

LSGETGQSGNTTIEEDSTTHVKFSKRDANGKELAGAMIELRNLSGQTIQSWISDGTVKVFYL MPGTYQFVETAAPEGYELAAPITFTIDEKGQIWVDS(SEQ ID NO.8所示)。

在一种实施方式中，编码所述α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。