[发明专利]JAK1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用

说明书

本发明属于分子病毒学和细胞生物学技术领域，公开了一种酪氨酸激酶蛋白JAK1泛素化位点赖氨酸lysine(K)859和860在制备干扰素耐受细胞中的应用。本发明发现流感病毒(IAV)PB2蛋白与JAK1蛋白发生相互作用，并通过泛素‑蛋白酶体途径降解JAK1。最终明确JAK1蛋白的K859和860是其泛素化位点。本发明将JAK1蛋白第859和860位的K突变为精氨酸arginine(R)，解除JAK1所受到流感病毒PB2介导的泛素化降解，同时也降低了JAK1介导的ISGs的产生从而抑制了其介导的抗病毒活性。该位点有望成为开发制备干扰素耐受细胞的新靶点。

技术领域

本发明属于分子病毒学和细胞生物学技术领域，公开了一种JAK1蛋白的 K859/K860位点在在制备干扰素耐受细胞中的应用。

背景技术

JAK/STAT信号通路是介导包括干扰素(interferon，IFN)在内的多种细胞因子下游信号转导的重要通路，对于细胞因子功能的发挥具有重要作用。其中酪氨酸激酶JAK(Januskinase)家族包含四种蛋白，分别为JAK1，JAK2，JAK3和TYK2。不同细胞因子功能的发挥依赖于不同组合的JAK/STAT信号通路，最终介导细胞因子下游效应基因的转录，进而发挥相应的免疫调控作用，对于宿主机体免疫反应的发挥至关重要。泛素化修饰在蛋白降解过程中发挥重要作用，研究显示JAK1的降解依赖于泛素连接酶和泛素化修饰过程，例如泛素连接酶RNF125可以介导JAK1的泛素化降解，JAK1的泛素化降解可以抑制 IFNs和白细胞介素下游信号通路的转导，进而对宿主细胞的免疫反应发生调节作用。病原微生物可以通过促进JAK1降解而拮抗其介导的宿主免疫反应。研究显示，如人巨细胞病毒(HCMV)、人偏肺病毒(HMPV)和寨卡(Zika) 病毒可以通过促进JAK1的蛋白酶体途径降解，抑制IFN抗病毒效应。流感病毒(IAV)的蛋白降解JAK1的具体机制以及降解JAK1关键的氨基酸位点还不清楚。通过IAV PB2蛋白降解JAK1，探究JAK1的关键功能性位点，对有效地开发制备干扰素耐受细胞具有重要意义。

发明内容

本发明发现JAK1蛋白第859和860位的K突变为R，降低了JAK1介导的ISGs的产生，从而抑制了其介导的抗病毒活性。研究表明流感病毒(IAV) PB2蛋白通过与JAK1相互作用并以泛素-蛋白酶体依赖方式降解JAK1。进一步证明JAK1的K859/K860位点是IAV PB2蛋白降解的关键氨基酸位点。因此，可以通过探究病毒蛋白降解JAK1的位点，筛选JAK1介导ISGs的功能性位点。

本发明具体采用以下技术方案：

JAK1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，所述JAK1蛋白泛素化位点位于JAK1蛋白第859和860位，JAK1氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

进一步的，JAK1核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述JAK1蛋白来源为哺乳动物。

进一步的，所述JAK1蛋白第859和860位的K突变为R后，消除JAK1 的泛素化位点，解除JAK1所受到的泛素化调控。

进一步的，位点突变采用的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 所示。

进一步的，所述的细胞为HEK293T，MDCK，A549细胞。

进一步的，构建用于慢病毒包装的shRNA质粒，将shRNA或shJAK1和 JAK1质粒的转染HEK293T细胞，进行慢病毒包装，将质粒进行转染，收集包含病毒的培养液。

进一步的，所述JAK1基因的shRNA靶点序列如下：

shJAK-1#序列为SEQ ID NO：5；

shJAK-2#序列为SEQ ID NO：6。