[发明专利]一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法

权利要求书

1.一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，其特征在于，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18s rRNA基因引物组合；所述牛链球菌RecN基因引物组合为引物组合I，包括以下6个引物：

RecN 1-F3：GGTCGTTCTATTAGCCGTATC；

RecN 1-B3：TCTCGATAGTGTTTTTTGACAG；

RecN 1-FIP：ACCGTGAATATCAACCAAGTACTGCGGTCAAATGGTTAATCTGAC；

RecN 1-BIP：TGACCAAGAAGAATTAATGAAGCCCCTGAAAAATGTTCATCCCCAA；

RecN 1-LoopF：CAACCGCACGAAGGGTT；

RecN 1-LoopB：AACATGCACATCCGTATGCT；

所述牛球虫18s rRNA基因引物组合为引物组合II，包括以下6个引物：

18s rRNA3-F3：ACGCAAGGAAGTTTGAGGC；

18s rRNA3-B3：GGGCGGTGTGTACAAAGG；

18s rRNA3-FIP：ACCTTCCGGCCAAGGTCAAGA-CCCTTAGATGTTCTGGGCTG；

18s rRNA3-BIP：TGAGTGTGCATCGTGATGGGGA-AGCTGCTGACTTACGCCTA；

18s rRNA3-LoopF：TGCATGCATCAGTGTAGCG；

18s rRNA3-LoopB：TTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAG。

2.根据权利要求1所述的一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，其特征在于，所述引物组合I和引物组合II的灵敏度分别为1.0×10²copies/μL和1.0×10¹copies/μL。

3.一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样本总DNA；

(2)利用引物组合I和引物组合II进行LAMP扩增反应；

(3)结果判断，若引物组合I以所述总DNA为模板扩增成功，则为牛链球菌阳性结果；若引物组合Ⅱ以所述总DNA为模板扩增成功，则为牛球虫阳性结果。

4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，所述引物组合I中，引物RecN 1-F3、RecN 1-B3、RecN 1-FIP、RecN 1-BIP、RecN1-LoopF、RecN 1-LoopB的浓度分别为1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L；所述引物组合II中，引物18s rRNA3-F3、18s rRNA3-B3、18s rRNA3-FIP、18s rRNA3-BIP、18s rRNA3-LoopF、18s rRNA3-LoopB的浓度分别为1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L。

5.根据权利要求3所述的一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的条件为60℃-67℃，10-60min。

6.根据权利要求3所述的一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，所述结果判断是通过反应体系中苯酚红试剂的颜色变化得到；反应结束后，若反应体系是橙黄色，则为阳性结果，若反应体系是紫红色，则为阴性结果。

7.一种牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法在同时检测牛链球菌和牛球虫中的应用如下：

(1)制备用于检测导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫的试剂盒；

(2)鉴定导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫；

(3)检测待测样本中是否含有导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫。