[发明专利]一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法

说明书

本发明提供了一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法，涉及分子诊断的快速检测技术领域。针对牛链球菌和牛球虫双病原的核酸基因的双靶点同时检测的引物组合，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18srRNA基因引物组合；所述牛链球菌RecN基因引物组合为组合I，如序列表SeqIDNO.1～6所示；所述牛球虫18srRNA基因引物组合为引物组合II，如序列表SeqIDNO.31～36所示；所述牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18srRNA基因引物组合具有灵敏度强、特异性高的特点，实现了牛链球菌和牛球虫两个牛病原体的同时检测；所述检测反应在60℃‑64℃下，30‑60min即可完成；检测结果可视化，通过颜色变化即可判断样品是否存在牛链球菌或牛球虫，能广泛应用于牧区、农场等场所。

技术领域

本发明涉及分子诊断的快速检测技术领域，具体涉及一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法。

背景技术

牛链球菌(Streptococcus bovis)是牦牛瘤胃中常见的一种兼性厌氧菌，为非β-溶血性链球菌，存在于食草动物消化道内，会导致牦牛等反刍动物瘤胃酸中毒、腹泻等胃肠道疾病。牛球虫病是由多种类型的艾尔美球虫(Eimeria)寄生在牛体内引发的一种具有传染性的体内寄生虫病，是全世界牛中最常见的寄生虫病之一，艾美尔球虫主要寄生在牛的直肠和小肠部位，当牛接触到感染艾美耳球虫的食物之后，球虫直接进入到牛肠道卵囊中，然后分裂增殖，具有很强的感染性。在球虫侵染初期，由于寄生虫的数量相对较少，通常不会引发牛群出现典型的临床症状，但随着寄生虫在牛肠道中的进一步繁殖增长并产生大量毒素，会造成牛群的肠道异常蠕动，不能很好地消化饲料中的营养物质，粪便常会随着肠道异常蠕动排出体外，表现出严重的腹泻症状。上述两种病原均是近年来引起牦牛牧区流行且危害较大的牛疫病病原体，但基于诊断方法较为繁琐、基础执行不规范，准确度不高，严重威胁到牦牛的健康状态，为农牧业带来较大的经济损失，阻碍牦牛业的发展。

目前，牛链球菌的检测主要依靠细菌分离培养和16s rRNA测序技术，但细菌的分离培养复杂耗时、需要在专业实验室内由专业技术人员操作，因此测序技术需要专业的测序公司才能完成，无法实现在畜牧场对感染牛链球菌的牲畜进行快速现场检测。此外，传统的针对牛球虫的检测方法主要包括牛粪便样本中的卵囊进行形态学检查、饱和食盐水漂浮法和麦克马斯特法。然而，这些传统的牛病原寄生虫检测方法不具备特异性，且检测耗时，需要熟练的技术，存在一定的缺陷。由于牛链球菌和牛球虫是牦牛常见的病原体，均导致牦牛腹泻，无法从症状上区分牦牛的具体病因，因此需要开发一种快速、便捷、更具成本效益的方法准确识别牛链球菌和牛球虫两个牛病原体。

环介导等温扩增(LAMP)技术依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。

发明内容

针对上述问题，提供一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法，其中引物组合Ⅰ是根据牛链球菌RecN基因设计，引物组合Ⅱ是根据牛球虫18s rRNA基因设计，引物组合具有很高的灵敏度、特异性；反应在等温条件下进行，不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间、牧区等进行实时监测。

本发明采用下述的技术方案：

一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18s rRNA基因引物组合。

所述牛链球菌RecN基因引物组合为引物组合I，包括两个外引物RecN 1-F3和RecN1-B3、两个内引物RecN 1-FIP和RecN 1-BIP、两个环导引物RecN 1-LoopF和RecN 1-LoopB，序列表Seq ID NO.1～6所示。