[发明专利]假单胞菌的分离、富集培养方法及修复污染土壤的方法

权利要求书

1.一种假单胞菌的分离方法，其特征在于，包括：

培养菌液步骤，将带有混合微生物群的水样加入到含盐度为1.5-5％的营养肉汤中振荡培养，培养完成后将营养肉汤培养基中的菌液转接到PYCM培养基中继续培养；

逐级稀释步骤，吸取PYCM中的菌液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的菌液浓度梯度进行稀释；

涂布步骤，将含盐度为1.5-5％的PYCM培养基配制为固体平板，将稀释后各浓度梯度的菌液等量均匀滴落在固体平板上表面，然后将菌液涂布均匀，将PYCM固体平板置于30℃培养箱中培养3d，即可长出单个菌落；以及

平板划线步骤，将含盐度为1.5-5％的PYCM培养基配制为固体平板，用接种环挑取单个菌落划线到固体平板上，反复多次划线传代培养，得到纯种菌株，该纯种菌株的分类命名为Pseudomonas sp.strain KW-2。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离方法，其特征在于，在所述培养菌液步骤中，具体包括：

选取带有混合微生物群的铁锈水样以接种比2％接入到含有3.5％NaCl的营养肉汤培养基中培养，于温度为30℃、转速为150r·min^-1环境下富集培养3d，然后将该菌液以2％接种比接种到含有3.5％NaCl的PYCM培养基中，培养3d。

3.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离方法，其特征在于，在所述培养菌液步骤中，所述PYCM培养基的成分为：0.8g/L蛋白胨，0.2g/L酵母浸粉，0.1g/L磷酸氢二钾，0.2g/L硫酸镁，0.2g/L硝酸钠，0.1g/L氯化钙，0.1g/L氯化铵，1g/L柠檬酸铁铵，0.2g/L硫酸锰，0.1g/L碳酸铵；所述PYCM培养基的pH＝7.0±0.2，灭菌处理。

4.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离方法，其特征在于，在所述培养菌液步骤中，所述营养肉汤培养基的成分为0.1g/L营养肉汤；所述营养肉汤培养基的pH＝7.0±0.2，灭菌处理。

5.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离方法，其特征在于，在所述涂布步骤和所述平板划线步骤中，

将含盐度为1.5-5％的PYCM培养基配制为固体平板的步骤包括：将含盐度为1.5-5％的PYCM培养基灭菌后等待其冷却到(60±5)℃进行倒平板，让其凝固，冷却到室温后形成所述固体平板；

所述将菌液涂布均匀步骤包括：用涂布器将菌液来回涂布在所述固体平板上，操作30s让菌液均匀分布。

6.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离方法，其特征在于，在所述平板划线步骤中，挑取单个菌落反复多次划线传代培养的方式包括：依此挑取单菌落划线传代培养3次，以3d为一周期。

7.一种用于富集培养假单胞菌的方法，其特征在于，包括步骤：

将使用权利要求1至6任一项所述假单胞菌的分离方法获得纯种菌株接种到富集营养肉汤培养基中进行富集培养，形成修复用原液；其中所述富集营养肉汤培养基的成分为19g/L营养肉汤；所述富集营养肉汤培养基的pH＝7.0±0.2，灭菌处理。

8.一种修复污染土壤的方法，其特征在于，包括：

制备修复用原液步骤，获取权利要求7所述用于富集培养假单胞菌的方法形成的修复用原液；

制备修复菌混合液步骤，将所述修复用原液离心分离，倒出上清液，将离心后的菌体和Mn²⁺溶液加入PYCM培养基中，翻转震荡，充分摇匀，形成修复菌混合液；以及

修复土壤步骤，将所述修复菌混合液投加到污染土壤中，搅拌均匀后置于30℃条件下培养15天。