[发明专利]一种油杉体细胞胚发生体系的建立方法及其应用

说明书

本发明提供了一种油杉体细胞胚发生体系的建立方法及其应用，属于林业中细胞工程种苗繁殖领域。本发明所述油杉体细胞胚发生体系的建立方法包括：以未成熟合子胚为外植体进行诱导培养、增殖培养、调整培养和成熟培养，分化形成体细胞胚。本发明所述方法成功建立了油杉体细胞胚胎发生体系，突破了油杉营养繁殖困难，生长周期长，发芽率低等瓶颈，成为林木快速繁殖、优异性状保持和品种改良的一条新兴途径。

技术领域

本发明属于林业中细胞工程种苗繁殖领域，尤其涉及一种油杉体细胞胚发生体系的建立方法及其应用。

背景技术

云南油杉(Keteleeria evelyniana)属松科油杉属，是东南亚特有的松科孑遗植物，喜暖耐干旱，具有强阳性、抗旱、耐瘠薄等特点，树皮栓皮层厚，耐火性强，具有重要的生态和经济价值。云南油杉天然分布于云南西北部至中部，贵州西部至西南部，四川西南部至西部，海拔分布范围1100～2300m。近几十年，由于人为的开垦、开发，导致其生境破碎化，为了第三纪孑遗属植物资源的保护利用和濒危种保育，有必要建立规模化的高效繁育体系。在自然界，云南油杉主要通过种子进行繁殖，种子发芽和成苗受到众多因素的影响，包括种子质量及环境生态因子等，繁殖效率低。目前，现有技术中云南油杉也主要通过种子进行有性繁殖，然而云南油杉种子含油脂、不耐贮藏，只能随采随播，且云南油杉的种子发芽率低，一颗种子只能发育形成一颗树，这些都不利于常规的种子繁殖对云南油杉进行扩繁，因此，有必要开发建立云南油杉的无性繁殖方式。

体细胞胚胎发生是指体细胞在人工控制的条件下，未经性细胞融合而经过一系列与合子胚发生类似的途径发育形成新个体的形态发生过程。植物体细胞胚胎发生是针叶树种通过生物技术手段进行规模化无性繁殖的重要途径。在林木的大量繁殖、种质保存和遗传转化等诸多领域中具有巨大的应用价值。但不同属之间体细胞胚发生的条件差异非常大，甚至是同一个属不同种之间体细胞胚发生的条件也差异非常大，因而关于云南油杉的体细胞胚发生体系的建立方法并未有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种油杉体细胞胚发生体系的建立方法，突破了油杉营养繁殖困难，生长周期长，发芽率低等瓶颈，成功建立了油杉体细胞胚胎发生体系。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种油杉体细胞胚发生体系的建立方法，所述方法包括：以未成熟合子胚为外植体进行诱导培养、增殖培养、调整培养和成熟培养，分化形成体细胞胚。

优选的，所述合子胚处于原胚团时期、胚胎形成早期及胚胎形成晚期。

优选的，所述诱导培养、增殖培养、调整培养、成熟培养的基础培养基为改良1/2MS培养基；

所述改良1/2MS培养基中KI 4.1～4.2mg/L、H₃BO₃ 15.4～15.6mg/L、VitaminB₁0.9～1.1mg/L、Vitamin B₆0.9～1.1mg/L。

优选的，诱导培养基为：改良1/2MS培养基+2,4-D 0.2～1mg/L+6-BA 0.1～2mg/L+KT 0～0.5mg/L+TDZ 0～0.01mg/L+肌醇80～120mg/L+水解酪蛋白450～550mg/L+谷氨酰胺400～500mg/L+蔗糖25～35mg/L+琼脂6～8g/L；pH为5.8～6.2。

优选的，增殖培养基为：改良1/2MS培养基+2,4-D0.05～0.15mg/L+6-BA0.02～0.09mg/L+肌醇450～550mg/L+水解酪蛋白450～550mg/L+谷氨酰胺400～500mg/L+蔗糖25～35mg/L+琼脂6～8g/L；pH为5.8～6.2。