[发明专利]用于肝癌初筛和预后的检测试剂盒及用途

说明书

本发明属于分子生物学肿瘤筛查领域，具体涉及用于肝癌早期初筛和预后的检测试剂盒及用途。本发明提供基于LAMP用于肝癌初筛和预后的检测试剂盒，包括扩增所需的如下引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.9所示。本发明将LAMP方法用于检测HCC患者Linc00853的表达，通过设计出LAMP核心引物(F3、B3、FIP和BIP)和环引物(LF、LB)，并通过优化反应温度、引物浓度、酶量等参数，筛选LAMP检测Linc00853最适宜条件。本发明提供的基于LAMP用于肝癌初筛和预后的检测试剂盒为本领域早期肝癌以及肝硬化预警和筛查提供了新的有效检测方法，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学肿瘤筛查领域，具体涉及用于肝癌早期初筛和预后的检测试剂盒及用途。

背景技术

外泌体(exosome)由多种细胞分泌，直径大小40-160nm(平均100nm)，双层脂质包裹的囊泡样结构，属于细胞外囊泡的一种。随着研究深入，外泌体的功能和价值逐渐凸显。1)用于液体活检，外泌体存在于各种体液中(如脑脊液、唾液、血液、尿液和母乳等)，可作为疾病诊段和预后的观测指标。对于肿瘤细胞，研究发现外泌体可促进其形成、生长；可指导其定植于新的转移位点，因此可用于预测未来肿瘤转移倾向及其部位。2)细胞间通讯，可探究疾病发生发展机制。外泌体可以通过直接与细胞膜的融合释放胞内物质、受体-配体作用、内吞或胞饮进行信息传递。3)药物输送。具有生物膜结构的外泌体被开发为药物运送载体，其有着耐受性好、安全、免受酶降解、免受机体吞噬、具有归巢能力等优势。

伴随高通量测序的发展，大量非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)被发现，其生物学功能研究也逐渐展开。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)受到了人们的关注。外泌体LncRNA也是细胞间通讯成分。其在肿瘤中的作用和外泌体类似，既可以作为诊断和预后的靶标，也能调控肿瘤的增值、迁移和凋亡，还能作用于肿瘤微环境，其在肿瘤耐药中还发挥作用。然而LncRNA的检测手段缺乏，主要为RT-qPCR和基因芯片的方式，前者检测灵敏度不够，后者成本较高。

基于环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术从2000年建立至今已有20余年历史，检测原理和方法相对成熟，主要通过链的置换与合成对目标片段进行不断合成和延伸。其扩增方式经历哑铃状(两边呈环状)模板形成、循环、延伸和再循环过程。内引物先与目标链结合，生成的新片段被外引物置换出后与自身5’端互补形成环状结构的一端。在两侧内引物作用下两端均生成环状结构，形成带有目的片段的哑铃状模板。哑铃状结构本身的3’端继续延伸，此时内引物与哑铃状结构结合后延伸，将哑铃状结构的延伸链置换出来。延伸链由于自身互补片段存在生成环状后又开始以自身为模板进行延伸，最后置换出内引物合成的哑铃状环结构进入不断循环扩增，而最开始的哑铃状模板形成自身不断延伸、目的片段不断扩增的长链状结构。该方式扩增速度快，不足一小时即可将少量拷贝数的DNA片段扩增至10⁹倍，还可通过增加环引物加快扩增速度。其作为产物可视化的恒温扩增技术，不需要昂贵的热循环仪，所需酶种类少，结果读取直观方便，成本低廉，适合于偏远贫困地区及床旁的检测。目前LAMP应用广泛，可用于病原体识别、基因检测、生物标志物检测等多个方面。